骨關節炎（OA）是一種普遍的退行性關節疾病，尤其在老年人中更為常見。其特征是一系列漸進性的病理變化，包括關節軟骨（AC）的退化、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化以及骨贅的形成（Abramoff和Caldera，2020）。從臨床角度來看，OA表現為持續的膝關節疼痛、關節僵硬、活動能力下降，在晚期會導致不可逆的殘疾——給醫療系統和社會經濟穩定帶來重大負擔（Allen等人，2022）。盡管導致OA發展的確切機制尚未完全明了，但已確定一些風險因素與其發病和進展有關，如關節創傷、代謝異常、與年齡相關的細胞衰老以及異常的生物力學應力（Dong等人，2023）。值得注意的是，盡管OA的發病率很高，但目前尚無能夠改變疾病進程的治療藥物；因此，治療選擇仍然局限于癥狀緩解或侵入性手術（如關節置換術）（Martina等人，2022）。這凸顯了迫切需要揭示控制OA發病機制的分子途徑，以便開發能夠阻止疾病進展的針對性干預措施。

OA的藥物治療已成為研究的關鍵領域，抗炎藥物和蛋白酶抑制劑在緩解患者癥狀方面發揮了重要作用。Kallikrein相關肽酶（KLK）家族包含15種進化上保守的絲氨酸蛋白酶（KLK1–KLK15），它們由位于19q13.4染色體上的連續基因簇編碼（Filippou等人，2016）。這些酶以無活性的前體形式合成，并經歷細胞外的蛋白水解激活，這一嚴格調控的過程對其在穩態和疾病發病機制中的作用至關重要（Yoon等人，2013）。KLKs參與多種復雜的蛋白水解級聯反應，涉及從皮膚病和心血管疾病到神經炎癥過程和腫瘤發生（Clements等人，2001）。新的證據表明KLK8在多種組織中具有多功能作用。在中樞神經系統中，KLK8在血腫周圍腦組織中的上調會通過放大促炎細胞因子的釋放而加劇神經炎癥（Tang等人，2023）；而在抑郁障礙中，它會導致海馬神經元凋亡（Xu等人，2023）。在腫瘤發生方面，KLK8通過促進結直腸癌細胞的增殖和轉移而驅動腫瘤進展（Hua等人，2021）。除了其病理作用外，KLK8還參與生理過程，如突觸重塑、認知功能（Shiosaka和Ishikawa，2011）和適應性心臟肥大（Cao等人，2016）。從機制上講，KLK8對細胞外基質（ECM）動態具有雙重影響：它直接切割ECM成分，并間接增強纖溶酶介導的蛋白水解（Rajapakse等人，2005）。值得注意的是，其通過基質金屬蛋白酶-20（MMP20）的激活表明，在疾病背景下，KLK和MMP途徑之間存在協同作用，尤其是在組織降解和重塑過程中（Yoon等人，2013）。對手術誘導的OA小鼠模型中的軟骨蛋白酶進行的全基因組微陣列分析發現，包括Mmp3、Capn2以及兩種先前未報道的軟骨相關蛋白酶Prss46和KLK8在內的多種蛋白酶顯著上調（Bateman等人，2013）。雖然Mmp3和Capn2在OA中的作用已被充分研究，但在關節軟骨中發現Prss46和KLK8的表達是一個新發現，因為這兩種蛋白酶此前未在該組織中被檢測到。Prss46是一種研究較少的絲氨酸蛋白酶，僅被認為與雄性小鼠的生育能力維持有關（Holcomb等人，2020），目前尚無研究探討其在其他生物系統中的信號通路或功能作用。相比之下，KLK8已在多種病理背景下得到廣泛研究，盡管其在OA發病機制中的潛在作用尚未完全探索。值得注意的是，KLK8已知的ECM降解能力，加上其在其他組織中促進炎癥和凋亡的作用，提示了它可能通過以下幾種機制促進OA進展：（1）直接降解軟骨ECM成分；（2）增強軟骨溶解；（3）放大局部炎癥反應；（4）誘導軟骨細胞凋亡。這些潛在機制使KLK8成為值得系統研究的OA發病機制的候選介質。

作為絲氨酸蛋白酶，KLKs通過蛋白酶激活受體（PARs）發揮生物學作用，這是一類普遍表達在細胞表面的G蛋白偶聯受體。PARs的蛋白水解激活會啟動下游信號級聯反應，特別是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）通路，這些通路在炎癥反應中起著關鍵作用（Mella等人，2020；Oikonomopoulou等人，2006；Rothmeier和Ruf，2012）。NF-κB是OA進展中的關鍵通路，它驅動分解因子（MMP-13、ADAMTS5）的上調、合成因子（II型膠原COL2A1）的下調以及炎癥細胞因子的產生（Yao等人，2023）。鑒于其已知的蛋白水解活性和這些機制學見解，我們假設KLK8可能通過NF-κB介導的軟骨基質降解、持續的炎癥反應和軟骨穩態的破壞來加劇骨關節炎的進展。

焦亡通過其裂解性和促炎性質顯著促進OA的進展（An等人，2020）。這種由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體激活引發的caspase-1介導的細胞死亡途徑，會切割gasdermin D并釋放成熟的IL-1β（Fang等人，2020；Zu等人，2019）。NLRP3的激活需要：（1）NF-κB依賴的啟動和（2）炎性小體的組裝（NLRP3寡聚化、ASC招募、caspase-1激活）（Shao等人，2015）。由此產生的NLRP3-ASC-caspase-1復合物驅動炎癥細胞因子的成熟并傳播焦亡性細胞死亡（Ge等人，2021；He等人，2016）。在OA中，升高的NLRP3炎性小體活性與過度的細胞因子產生相關，加劇了滑膜炎和軟骨退化（Li等人，2021；McAllister等人，2018）。雖然多種通路可以激活NLRP3，但其在軟骨細胞中的具體調控機制仍不清楚。考慮到NF-κB和NLRP3在炎癥中的協同作用（Li等人，2021）以及KLK8已知的促炎功能，我們假設KLK8可能在OA發病機制中調節NLRP3炎性小體的激活。

總之，我們提出了一個機制假設：在炎癥軟骨細胞中KLK8的上調通過NF-κB激活啟動了一個病理級聯反應，導致：（1）分解因子（MMP-13、ADAMTS5）的表達升高；（2）合成因子（COL2A1、蛋白多糖）的抑制；（3）NLRP3炎性小體活性的增強。NF-κB和NLRP3信號之間的協同作用放大了促炎細胞因子的產生、細胞外基質的降解和焦亡性細胞死亡——共同加劇了骨關節炎的進展。這項研究將為理解控制軟骨退化和軟骨細胞焦亡的分子機制提供新的見解，可能揭示改變疾病的新治療靶點。

為了研究KLK8的表達及其在OA中的潛在作用，我們建立了MLI誘導的OA小鼠模型。使用Safranin-O和HE染色來評估關節軟骨的糖胺聚糖含量和軟骨破壞情況——這是OA病理的兩個指標（圖1A）。OA組的Mankin評分顯著高于假手術組（圖1B）。免疫熒光（IF）染色顯示，與假手術組相比，OA組中有更多的KLK8陽性細胞（圖1C，D）。

本研究通過體內和體外實驗闡明了KLK8在OA發病機制中的作用，旨在明確其在OA關節軟骨中的表達及其在軟骨退化、炎癥和焦亡中的作用。我們的結果表明，KLK8在人類患者和實驗小鼠模型的OA關節軟骨中顯著上調，并且其表達在體外受到IL-1β的誘導。功能實驗進一步證實，KLK8促進

我們的研究表明，KLK8是OA中軟骨細胞炎癥、焦亡和軟骨破壞的關鍵調節因子，這一作用通過NF-κB和NLRP3炎性小體途徑介導。這些發現加深了我們對OA發病機制的理解，并強調了KLK8作為疾病修飾治療靶點的潛力。

我們的動物實驗方案得到了江蘇漢江生物學研究所動物護理和使用委員會的批準（批準編號：HJSW-23022001；日期：2023年2月）。本研究獲得了附屬泰州人民醫院機構審查委員會的批準，并遵循赫爾辛基宣言的原則進行。所有參與者在組織采集前均提供了書面知情同意。

作者聲明在準備本手稿期間未收到任何資金、資助或其他支持。

所有作者對本文所述的工作和修訂過程做出了實質性貢獻：徐立斌設計了研究，起草了原始手稿，并根據審稿人的意見進行了修訂；徐立斌和江澤宇進行了實驗（包括修訂中的補充實驗）并分析了數據（包括數據重新分析）；李海軍監督了研究和修訂工作，全面修訂了手稿，并批準了最終修訂版本。