基于QbD（量子點生物傳感）技術的穩(wěn)定性指示高效液相色譜（HPLC）方法，該方法結合了卡維地洛（carvedilol）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil），并在跨細胞膜轉運系統(tǒng)中實現(xiàn)應用
《Toxicologie Analytique et Clinique》：Stability-indicating HPLC method enabled by QbD based combination with carvedilol and 5-fluorouracil in a transethosomal system
編輯推薦：
基于QbD設計優(yōu)化高效液相色譜法，同步測定納米遞送系統(tǒng)中 carvedilol (CVD) 與 5-fluorouracil (5-FU) ，Kromasil C18柱，60:40流動相比例，254 nm檢測，線性范圍CVD 50-150 μg/mL，5-FU 100-300 μg/mL，檢測限3.73/6.08 μg/mL，定量限11.31/18.43 μg/mL，符合FDA標準，適用于抗癌藥物遞送系統(tǒng)分析。
普拉富爾·辛德（Prafull Shinde）|阿米特·佩奇（Amit Page）
藥劑學系，SVKM NMIMS全球大學藥學院與技術管理學院，地址：印度馬哈拉施特拉邦杜萊（Dhule）424001，孟買-阿格拉國家公路（Mumbai–Agra National Highway）旁古魯?shù)峦呃℅urudwara）后方499號地塊02號
摘要
本文建立了一種靈敏、可靠且穩(wěn)定的高效液相色譜（HPLC）方法，并將其與卡維地洛（Carvedilol，簡稱CVD）和5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，簡稱5-FU）結合，用于創(chuàng)新的納米囊泡跨細胞膜藥物遞送系統(tǒng)。通過Box-Behnken QbD方法進行方法開發(fā)，以系統(tǒng)地實現(xiàn)最佳的色譜性能、足夠的分辨率和縮短的分析時間。采用目標分析剖面（Target Analytical Profile，簡稱TAP）來確定影響其質量特性的關鍵參數(shù)。研究結果表明，有機溶劑的百分比、流動相的pH值和緩沖液的強度是關鍵影響因素。QbD設計主要評估了關鍵的分析參數(shù)以及適當?shù)目刂撇呗浴Ｊ褂肒romasil C18柱高效分離樣品。最終確定的流動相比例為60:40，流速為1 mL/min，在254 nm的等滲點處進行實驗。該方法對CVD在50–150 μg/mL濃度范圍內以及5-FU在100–300 μg/mL濃度范圍內的檢測表現(xiàn)出很強的線性響應。CVD的檢測限為3.73 μg/mL，5-FU的檢測限為6.08 μg/mL和18.43 μg/mL。驗證結果符合FDA標準，強制降解實驗表明該方法能夠區(qū)分分析物及其降解產物。因此，該方法適用于需要高精度的先進癌癥治療應用。
引言
鑒于多種癌癥治療模式的協(xié)同效應，聯(lián)合用藥是傳統(tǒng)單一藥物治療的理想替代方案。此外，聯(lián)合用藥可以降低腫瘤復發(fā)的可能性以及減少治療耐藥性的風險[1]。由于卡維地洛（CVD）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的作用機制不同且毒性譜重疊較少，因此可以聯(lián)合使用[1]。CVD可用于治療卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、多種黑色素瘤、膠質母細胞瘤、口腔癌和白血病[2]。CVD是一種高效的β-腎上腺素能阻滯劑，IC50值為1 nM，已被重新用于癌癥預防治療[3][4]。CVD是非選擇性的β-腎上腺素能阻滯劑，同時具有抗氧化特性，化學名稱為1-(9H-咔唑-4-氧基)-3-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙氨基]丙-2-醇。它是一種親脂性分子，分子量小，對數(shù)分配系數(shù)（log P）為3.8。由于其極低的水溶性（屬于BCS II類藥物），因此為這類藥物的開發(fā)提供了大量機會[6]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種細胞毒性藥物，用于對抗多種惡性腫瘤。其化學結構為5-氟-1H-嘧啶-2,4-二酮[7]。5-FU已獲FDA批準，可用于治療多種皮膚問題，如日光性角化病和表淺基底細胞癌。此外，它還被批準用于治療胃腸道癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸腺癌[8]。這兩種藥物的結構如圖1A和圖1B所示。
除了FDA批準的用途（如治療耐藥的白癜風、角化棘皮瘤和由黑色素瘤引起的轉移性皮膚病變）外，臨床醫(yī)生還經(jīng)常使用5-FU治療各種皮膚相關疾病。有證據(jù)表明，對高風險人群進行為期四周的常規(guī)5-FU局部治療可降低鱗狀細胞癌的發(fā)病率[9]。已有多種分析方法用于測定CVD，包括HPLC–MS/MS、RP-HPLC（結合紫外檢測）和常規(guī)HPLC[10][11][12]。同樣，5-FU也通過LC–MS/MS[13]、HPLC[14]和LC–離子阱質譜[15]進行定量分析。然而，目前尚未有方法同時使用基于質量設計的分析方法來測定CVD和5-FU，尤其是在納米制劑系統(tǒng)中，這凸顯了本研究的必要性和創(chuàng)新性。選擇RP-HPLC（結合紫外檢測）是因為該方法在法規(guī)上被廣泛接受，并適用于常規(guī)質量控制，同時為未來向LC-MS平臺的轉換提供了靈活性。
最近的一些分析研究利用LC-MS/MS技術測定血液樣本中5-氟尿嘧啶、卡培他濱及其代謝物的濃度[16][17]，指出CVD是非極性分子，而5-FU是極性藥物。因此，開發(fā)一種同時測定這兩種藥物的方法存在挑戰(zhàn)。影響分析物在峰處保留行為的主要因素是總有機溶劑濃度和鹽濃度，以及稀釋水溶液中的pH值調整。
迄今為止，尚未有專門針對CVD和5-FU聯(lián)合測定的方法。雖然已有研究描述了這兩種藥物在溶液中的單獨定量方法，但尚未建立高效、快速的RP-HPLC方法以實現(xiàn)同時檢測。本研究通過開發(fā)一種RP-HPLC方法填補了這一空白，該方法能夠準確且精確地分析囊泡制劑中的這兩種藥物。所提出的方法符合國際協(xié)調委員會（ICH）的規(guī)定，證明了其在聯(lián)合劑型中可靠測定這兩種成分的適用性。采用標準的方法論和科學方法能夠獲得準確且可重復的分析結果。質量設計（Quality by Design，簡稱QbD）框架有助于系統(tǒng)管理多個分析變量之間的復雜相互作用，從而實現(xiàn)高效的方法優(yōu)化和建立穩(wěn)健的控制策略[18][19]。ICH Q14指南的引入，結合ICH Q8和ICH Q11，為分析程序的開發(fā)提供了結構化的監(jiān)管框架。本研究的結果表明，該方法在監(jiān)管合規(guī)性和工業(yè)應用性方面表現(xiàn)出色，驗證了其適用性、可靠性和效率[20][21]。
經(jīng)驗證的方法為先進分析方法的發(fā)展和分析優(yōu)化提供了堅實的基礎，提高了性能和重現(xiàn)性，從而實現(xiàn)了優(yōu)異的分析結果。采用該指南有望促進行業(yè)與監(jiān)管機構之間的溝通，推動更高效、科學驗證且穩(wěn)健的分析流程，特別是在方法驗證協(xié)議發(fā)生重大變化后[22]。許多研究表明，優(yōu)化原則可用于開發(fā)多種用途的分析方法[23][24]。目前市場上缺乏相應的制劑，這突顯了驗證分析方法的必要性，以支持藥物研發(fā)的早期階段。本研究的主要目標是根據(jù)ICH Q14原則，開發(fā)并驗證一種穩(wěn)健的RP-HPLC方法，用于同時測定5-FU和CVD。次要目標是證明該方法適用于共載跨細胞膜納米囊泡制劑的分析，從而驗證其在制劑開發(fā)、穩(wěn)定性評估和常規(guī)質量控制中的適用性。
材料
CVD由印度特倫甘納邦海得拉巴（Hyderabad, Telangana）的Carbanion公司提供。5-FU作為贈品樣本由印度馬哈拉施特拉邦浦那（Pune, Maharashtra）的Thermofischer Scientific公司提供。尼龍膜（孔徑0.22 μm）由Globe Scientific公司提供。本研究中使用的所有化學品均具有最高純度，包括磷酸二氫鉀-AR級、鹽酸、甲醇-HPLC級和乙腈（99.9%，Sigma-Aldrich，美國）。所使用的化學品和溶劑均為分析試劑和HPLC級。
色譜參數(shù)的優(yōu)化
首先觀察了CVD和5-FU的保留模式和色譜性能，與C18柱的固定相和流動相組成比例有關。選擇C18柱進行進一步的技術開發(fā)，因為它表現(xiàn)出令人滿意的色譜分離效果。為了獲得更清晰的峰形和可重復的峰對稱性，初步實驗使用了40:60比例的有機溶劑（乙腈）和水混合溶液。
結論
所提出的方法使用RP-HPLC簡單、快速且易于操作，適用于CVD和5-FU的測定。該方法符合ICH建議，顯示出高準確性、精確性和穩(wěn)健性。強制降解測試表明，這兩種劑型的降解產物并未影響CVD和5-FU的色譜圖。該方法能夠有效分離這兩種化學物質。因此，該方法的開發(fā)具有重要意義。
出版同意
作者同意發(fā)表本文。
資金來源（如有）
無。
作者貢獻聲明
P.S.：負責實際操作、撰寫初稿和與期刊的溝通。
A.P.：負責正式分析、修訂、數(shù)據(jù)整理、編輯和提出建議。
利益沖突聲明
作者聲明沒有利益沖突。
致謝
作者衷心感謝SVKM NMIMS的副院長以及SVKM NMIMS Deemed-to-be University的Mukesh Patel Technology Park Management在項目期間提供的優(yōu)秀研究設施和鼓勵。
