《Tissue and Cell》：CCL18 binding to MAPT promotes chronic obstructive pulmonary disease by inhibiting autophagy and triggering cell senescence
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本研究針對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）中趨化因子CCL18高表達(dá)但其促病機(jī)制不明的問題，探討了CCL18通過結(jié)合并上調(diào)微管相關(guān)蛋白tau（MAPT）的表達(dá)，進(jìn)而抑制自噬、觸發(fā)細(xì)胞衰老，從而加速COPD發(fā)展的新機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在臨床樣本、小鼠和細(xì)胞模型中敲低CCL18可激活自噬、延緩細(xì)胞衰老、減輕肺部炎癥和病理損傷。該研究揭示了CCL18-MAPT-自噬-衰老軸是COPD進(jìn)展的關(guān)鍵通路，為靶向CCL18治療COPD提供了新的理論依據(jù)。
在我們的肺部深處，每時(shí)每刻都在進(jìn)行著關(guān)乎生命存續(xù)的、安靜而復(fù)雜的交換。然而，對(duì)于全球數(shù)以億計(jì)的慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）患者而言，這個(gè)過程正變得越來越艱難。COPD是一種以進(jìn)行性、不可逆的氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)頑疾，長(zhǎng)期吸煙是其最主要的誘因。盡管已知慢性炎癥、細(xì)胞衰老和自噬（autophagy）功能障礙是推動(dòng)COPD發(fā)展的核心機(jī)制，但它們之間如何相互聯(lián)系，是否存在一個(gè)關(guān)鍵的“始作俑者”分子，一直懸而未決。近年來，趨化因子（chemokine）CCL18在COPD患者血清和肺部表達(dá)升高，并與肺功能損傷程度相關(guān)，但它究竟是疾病的“旁觀者”還是“推手”，其具體作用機(jī)制如一團(tuán)迷霧。解開這個(gè)謎團(tuán)，不僅有助于我們更深刻地理解COPD的病理生理，也可能為這個(gè)缺乏有效根治手段的疾病，點(diǎn)亮一盞通往新療法的明燈。
為此，由昆明理工大學(xué)附屬安寧市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的研究人員領(lǐng)銜的團(tuán)隊(duì)，在期刊《Tissue and Cell》上發(fā)表了一項(xiàng)研究，他們像偵探一樣，追蹤了CCL18在COPD中的“犯罪證據(jù)”和“作案手法”。他們的核心發(fā)現(xiàn)是：CCL18扮演了一個(gè)不光彩的“加速器”角色。它通過與另一個(gè)名為微管相關(guān)蛋白tau（Microtubule-Associated Protein Tau, MAPT）的蛋白直接“握手”（結(jié)合），穩(wěn)定并上調(diào)MAPT蛋白水平。而升高的MAPT則會(huì)像一個(gè)“路障”，阻礙細(xì)胞自噬的正常進(jìn)行。自噬是細(xì)胞內(nèi)部的“清潔回收系統(tǒng)”，它的失靈導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有毒廢物堆積，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞衰老程序。衰老的細(xì)胞不僅功能喪失，還會(huì)像一個(gè)個(gè)“炎癥小火山”，持續(xù)釋放白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎因子，形成惡性循環(huán)，最終加劇肺部組織破壞和功能下降。反過來，如果敲低CCL18，就能拆除這個(gè)“路障”，恢復(fù)自噬功能，延緩細(xì)胞衰老，從而顯著減輕COPD的病理損傷。這項(xiàng)研究首次勾勒出“CCL18–MAPT–自噬–衰老”這條全新的信號(hào)軸，為干預(yù)COPD提供了極具潛力的新靶點(diǎn)。
為了揭示上述機(jī)制，研究人員運(yùn)用了多層次、多角度的實(shí)驗(yàn)策略。在臨床層面，他們收集了穩(wěn)定期COPD患者和健康對(duì)照者的支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF）樣本進(jìn)行分析。在動(dòng)物模型上，他們構(gòu)建了經(jīng)典的香煙煙霧（Cigarette Smoke, CS）暴露誘導(dǎo)的小鼠COPD模型，并利用慢病毒在體內(nèi)敲低CCL18。在細(xì)胞模型上，他們使用香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract, CSE）處理人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞，模擬COPD的細(xì)胞損傷環(huán)境，并通過慢病毒感染進(jìn)行基因敲低或過表達(dá)操作。研究所采用的關(guān)鍵技術(shù)方法包括：蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)基因和蛋白表達(dá)；免疫熒光（Immunofluorescence）和共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）驗(yàn)證蛋白定位與相互作用；衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色評(píng)估細(xì)胞衰老；單丹磺酰尸胺（Monodansylcadaverine, MDC）染色和自噬標(biāo)志蛋白檢測(cè)評(píng)估自噬流；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)炎癥因子及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平；以及蘇木精-伊紅（H&E）染色進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估。
3.1. CCL18在COPD中高表達(dá)
研究人員首先從多個(gè)角度證實(shí)CCL18是COPD的“高風(fēng)險(xiǎn)分子”。生物信息學(xué)分析公共數(shù)據(jù)庫顯示，CCL18在COPD樣本中表達(dá)上調(diào)。在臨床收集的COPD患者BALF中，CCL18蛋白水平顯著高于健康對(duì)照。在CS暴露的小鼠肺組織中，CCL18蛋白表達(dá)同樣升高。更重要的是，H&E染色顯示這些小鼠肺部出現(xiàn)了典型的COPD病理改變，如肺泡間隔破壞、肺氣腫樣改變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這為后續(xù)研究建立了可靠的疾病模型。
3.2. CCL18調(diào)控CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞衰老
接下來，研究在細(xì)胞層面探究CCL18的功能。他們發(fā)現(xiàn)，直接用重組CCL18蛋白處理肺上皮細(xì)胞，能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，表現(xiàn)為SA-β-Gal陽性細(xì)胞增多，以及衰老標(biāo)志物（VEGF、MMP1、p27、p16、p21）表達(dá)上調(diào)，而核纖層蛋白Lamin B1表達(dá)下降。然而，CCL18的促衰老效應(yīng)比CSE弱，提示還有其他因素參與。當(dāng)研究人員在CSE處理的細(xì)胞中敲低CCL18時(shí)，情況發(fā)生了逆轉(zhuǎn)：細(xì)胞衰老被顯著抑制，衰老標(biāo)志物表達(dá)減少，同時(shí)衰老相關(guān)分泌表型因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和ROS水平也同步下降。這證明CCL18不僅是衰老的“誘導(dǎo)劑”，也是CSE引發(fā)衰老過程中的一個(gè)關(guān)鍵“調(diào)節(jié)器”。
3.3. CCL18通過抑制自噬促進(jìn)CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞衰老
既然自噬與衰老密切相關(guān)，研究自然將目光投向二者之間的鏈接。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CSE處理會(huì)抑制自噬，表現(xiàn)為自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1表達(dá)降低，而自噬底物p62堆積。敲低CCL18則能部分逆轉(zhuǎn)這種抑制，促進(jìn)自噬流恢復(fù)。為了確認(rèn)自噬在此過程中的作用，研究人員使用了自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-MA可以抵消CCL18敲低所帶來的抗衰老、抗炎和抗氧化益處。這清楚地表明，CCL18是通過“掐斷”自噬這條通路，來推動(dòng)細(xì)胞走向衰老的。
3.4. CCL18與MAPT結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)
CCL18是如何抑制自噬的呢？研究人員通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，找到了關(guān)鍵的下游“執(zhí)行者”——MAPT蛋白。數(shù)據(jù)庫分析提示CCL18可能與MAPT存在相互作用。免疫熒光共定位和Co-IP實(shí)驗(yàn)直接證實(shí)了CCL18和MAPT在細(xì)胞內(nèi)確實(shí)相互結(jié)合。機(jī)制探究發(fā)現(xiàn)，CSE處理能上調(diào)MAPT蛋白表達(dá)，而敲低CCL18則能降低MAPT蛋白水平，但不影響其mRNA水平。這說明CCL18很可能是通過結(jié)合MAPT，增強(qiáng)了其蛋白穩(wěn)定性，而非促進(jìn)其基因轉(zhuǎn)錄。
3.5. CCL18通過MAPT抑制自噬并促進(jìn)細(xì)胞衰老
為了確證MAPT是CCL18發(fā)揮作用的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)，研究人員進(jìn)行了“回復(fù)”實(shí)驗(yàn)。他們?cè)谇玫虲CL18的細(xì)胞中，同時(shí)過表達(dá)MAPT。結(jié)果顯示，MAPT過表達(dá)成功逆轉(zhuǎn)了CCL18敲低所帶來的積極效應(yīng)：自噬再次被抑制（LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1下調(diào)，p62上調(diào)），細(xì)胞衰老重新被激活（衰老標(biāo)志物、炎癥因子、ROS水平回升）。這完美地證明了CCL18正是通過上調(diào)MAPT，進(jìn)而抑制自噬，最終促進(jìn)細(xì)胞衰老。
3.6. 敲低CCL18通過激活自噬減輕體內(nèi)COPD病理
最后，研究在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了上述細(xì)胞層面的發(fā)現(xiàn)。在CS誘導(dǎo)的COPD小鼠模型中，通過尾靜脈注射敲低CCL18的慢病毒。結(jié)果令人振奮：敲低CCL18不僅降低了肺組織中MAPT蛋白水平，還激活了自噬，顯著抑制了肺組織細(xì)胞的衰老。在病理表現(xiàn)上，小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)破壞和氣道炎癥浸潤(rùn)得到明顯改善。同時(shí)，肺部衰老標(biāo)志物和促炎因子的水平也同步下降。這表明，靶向CCL18在整體動(dòng)物水平上同樣能有效延緩COPD進(jìn)展。
綜上所述，這項(xiàng)研究系統(tǒng)性地揭示了一條驅(qū)動(dòng)COPD發(fā)展的前所未知的信號(hào)通路：香煙煙霧等刺激導(dǎo)致趨化因子CCL18表達(dá)升高；高表達(dá)的CCL18與MAPT蛋白結(jié)合并穩(wěn)定后者；積累的MAPT蛋白抑制細(xì)胞的自噬過程；自噬受阻引發(fā)細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)分泌表型，導(dǎo)致持續(xù)的炎癥和氧化應(yīng)激，最終造成肺組織不可逆的損傷和功能喪失。這項(xiàng)工作的意義在于，它首次將CCL18置于COPD“自噬-衰老-炎癥”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置，并明確了MAPT是其關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。這不僅深化了對(duì)COPD，特別是吸煙相關(guān)COPD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，更重要的是，CCL18和MAPT作為潛在的藥物干預(yù)靶點(diǎn)，為開發(fā)全新的COPD治療策略（例如CCL18中和抗體、抑制劑或MAPT調(diào)節(jié)劑）提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。盡管該研究在臨床轉(zhuǎn)化、下游網(wǎng)絡(luò)細(xì)節(jié)等方面仍需深入探索，但它無疑為戰(zhàn)勝這一困擾全球的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，打開了一扇充滿希望的新窗口。
