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這篇綜述介紹了定量傾斜背照顯微鏡（qOBM）的重大革新——單次捕獲qOBM（SCqOBM）。該方法利用深度學習模型，僅需一次傾斜背照明捕獲即可精確重構相位信息，克服了傳統方法需四次捕獲的限制。它在成像速度、系統簡易性和樣本適應性（適用于任意厚度樣本）方面實現了變革性突破，成功應用于小鼠大腦和人手臂血流動態可視化、二維切片kHz級成像及三維折射率斷層掃描，為非侵入性血液學評估、體內組織成像等生物醫學研究與臨床診斷開辟了新前沿。
引言：快速無標記成像技術的需求與挑戰
生物醫學領域對快速、無標記且能提供清晰細胞與亞細胞對比的成像技術需求日益增長。現有技術各有取舍：光學相干斷層掃描（OCT）雖成像速度極快，但空間分辨率與細胞結構對比度低；無標記非線性顯微鏡（如相干拉曼散射、泵浦探測顯微鏡）分辨率高，但因需激光點掃描而速度慢、系統復雜昂貴且有組織損傷風險；無標記自發熒光光片顯微鏡速度快，但對比度有限且穿透深度淺。定量相位成像（QPI）已成為觀測活體、無標記樣本的重要工具，可研究納米級細胞結構與動態現象，但其傳統方法依賴于光透過樣本，限制了其在薄樣本（如單層細胞）中的應用。三維QPI（亦稱光學衍射斷層掃描ODT）雖能解析多層細胞，仍屬透射式技術，無法用于研究大型（通常厚于1-2個平均自由散射路徑）樣本。
定量傾斜背照顯微鏡（qOBM）的引入克服了QPI的這一重大局限。它利用反射式照明而非透射照明，能夠在任意厚度的樣本中實現高分辨率、無標記的定量相位成像和折射率斷層掃描，提供了與傳統QPI和ODT同樣豐富的定量信息。然而，qOBM的一個主要限制是需要四次捕獲來重構定量相位信息，這降低了最大成像速率、易受運動偽影影響并增加了系統復雜性。
SCqOBM：深度學習驅動的高速相位成像新方法
為提升qOBM成像速度，本研究引入了單次捕獲qOBM（SCqOBM）和雙次捕獲qOBM（TCqOBM）。SCqOBM利用深度學習（DL）的最新進展，通過一個經過對抗訓練的U-Net模型，直接從單次傾斜背照明捕獲中準確重構定量相位信息。TCqOBM則使用兩次正交的傾斜背照明捕獲作為輸入。這一革新旨在實現與光片顯微鏡相當的成像速度（均通過單次捕獲實現二維空間復用），同時具備與非線-性顯微鏡相似的分辨率和成像深度，并保有QPI獨特的定量對比度和亞細胞細節。該技術僅使用簡單、低成本的儀器（配備單個LED反射式照明的明場顯微鏡），顯著拓寬了快速無標記光學成像的適用性。
靜態（離體）樣本的快速qOBM成像驗證
臍帶血樣本：研究首先使用臍帶血樣本數據集訓練和測試SCqOBM與TCqOBM模型。結果顯示，SCqOBM和TCqOBM的重建圖像在結構上與傳統的四捕獲qOBM目標圖像幾乎相同。對紅細胞（RBCs）的定量折射率（RI）剖面分析表明，三者具有極好的一致性。性能評估顯示，TCqOBM的平均均方誤差（MSE）和結構相似性指數（SSIM）分別為0.0018和0.89，SCqOBM為0.0036和0.77。盡管SCqOBM定量精度略低于TCqOBM，但其在需要快速數據采集的應用中具有明顯優勢，且對于紅細胞這類形態對稱、結構受限的樣本，單次捕獲相位恢復效果出色。
離體大鼠腦組織樣本：隨后，研究在結構更復雜的大鼠腦組織數據集上評估了模型性能。該數據集包含健康大腦不同區域及腦腫瘤的圖像，具有高度多樣化的折射率分布。結果顯示，盡管腦組織極為復雜，TCqOBM和SCqOBM的深度學習相位恢復在重現所有類型結構的定量相位信息方面表現卓越。SCqOBM和TCqOBM的SSIM平均值分別為0.8和0.91，表明組織結構恢復得非常好。重要的是，即使在包含大量背景區域的圖像中，組織區域仍與目標圖像表現出顯著的一致性。模型在未見過的、結構迥異的人類膠質母細胞瘤組織上的成功重建進一步證明了其泛化能力。
頻域分析揭示方法差異
傅里葉域分析有助于理解qOBM與兩種DL重建方法之間的差異。傳統qOBM使用兩幅正交的微分相位對比（DPC）圖像，確保所有方向上的高保真定量相位恢復，其頻域覆蓋在橫向上是各向同性的。TCqOBM同樣因使用兩次垂直照明方向的捕獲而恢復了相位的全角度信息。SCqOBM為追求更快的成像，犧牲了沿一個方向的信息采集。對于結構高度可預測的血液細胞，SCqOBM模型能夠學習并恢復原始捕獲中缺失的角向信息。然而，對于結構復雜、異質性高的大腦組織，SCqOBM則無法預測/推斷缺失信息的內容，在頻域上表現為沿與傾斜照明方向垂直的窄帶內信息確實缺失，但模型并未在此區域“幻覺”出結構，而是讓該頻帶結構保持缺失狀態。
動態在體樣本的快速qOBM成像應用
在體小鼠大腦血流分析：研究利用SCqOBM以約2 kHz的成像速率對小鼠大腦（視窗模型）的血流進行了分析。通過分析沿血管線徑的折射率隨時間波動，可以計算血細胞速度，方法類似于M型超聲成像。研究量化了不同直徑血管（7、20和80 μm）的血流速度范圍，在最小血管中為1.1 mm/s，在最大血管中心達66.4 mm/s，并觀察到了符合生理預期的跨血管速度變化（泊肅葉流型）。此外，還觀察并表征了較大血管中緩慢移動的白細胞（WBCs）滾動現象，這對免疫反應研究具有重要意義。在成像過程中，隨著小鼠生命接近終點，附著的白細胞密度逐漸增加，這為研究疾病過程提供了可能。
在體人皮膚快速三維成像：研究最后展示了SCqOBM在體人皮膚（手臂）近視頻速率的體積折射率斷層掃描。通過增加Z軸壓電載物臺，并先由SCqOBM將原始強度堆棧轉換為二維相位切片，再經另一獨立的基于深度學習的3D算法處理，最終得到具有清晰細胞和亞細胞對比度的三維圖像。從表面至約100 μm深度，可觀察到角質層、顆粒層、棘層和基底層。在約100-150 μm深度，可觀察到真皮毛細血管中移動的血細胞。通過調整有效傳感器區域和Z平面數量，可以在不犧牲總信息通量（1.25 Gvoxels/s）的前提下，靈活調整空間范圍和時間分辨率，實現高達每秒10個體積的快速三維成像，能夠三維可視化健康志愿者真皮內毛細血管中的血流。
討論：SCqOBM的進步、優勢與前景
本工作提出的SCqOBM和TCqOBM顯著提高了qOBM的成像速度。TCqOBM恢復的相位信息在定性和定量上均與傳統的四捕獲qOBM幾乎相同。SCqOBM則最大化了qOBM的成像速度，在定性上產生與qOBM相同的結果，但在定量上，在垂直于傾斜照明光源的窄空間頻率范圍內缺乏結構信息。盡管如此，即使對于大腦等復雜樣本，SCqOBM在此窄帶范圍外仍保持了相對較高的定量保真度。模型在僅用大鼠腦組織數據訓練的情況下，成功泛化至人腦、人皮膚等不同組織類型，并適應了不同數值孔徑的物鏡、不同中心波長（如850 nm對720 nm）以及不同的光學配置（如基于GRIN透鏡的手持式探頭），展示了其魯棒的泛化能力。與需要跨序貫采集保持樣本靜止的傳統多捕獲qOBM相比，單次捕獲框架特別適合高度動態的成像場景，可避免運動偽影。SCqOBM在速度、簡易性、可及性及樣本厚度兼容性方面具有變革性優勢，其應用前景廣泛，涵蓋從無創血流分析到實時在體體積成像等多個領域，有望成為理解復雜生物系統和改善患者護理的寶貴工具。
