《Water Research》：Synergistic Nitrogen Removal by Robust Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification and Substantial Assimilation in a Novel
Zobellella sp
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分離到新型異養硝化反硝化菌株Zobellella sp. An-6，基因組揭示其具備硝化、反硝化、亞硝酸鹽硝化及銨態氮同化代謝全鏈條能力，動力學和同位素追蹤證實其在寬C/N比下可同步去除銨態氮和硝態氮，且優先利用銨態氮，其高效氮去除機制和快速生長特性為廢水處理提供新策略。
姚順|胡楚曉|歐宣|修琪|何紅林|侯亞漢|張新瑞|馬婷|顧吉東|夏文杰
教育部分子微生物學與技術重點實驗室，南開大學生命科學學院，天津300071，中國
摘要
異養硝化與好氧反硝化（HN-AD）菌株的發現挑戰了傳統觀點，即微生物去除氮依賴于多種硝化菌和反硝化菌之間的協同代謝。然而，它們的氮代謝途徑和應用潛力仍不清楚。在這里，我們分離出一種新型HN-AD菌株Zobellella sp. An-6，該菌株能夠在有氧和無氧條件下同時去除銨鹽和硝酸鹽。基因組分析顯示其具有銨鹽同化、硝化、反硝化、同化型硝酸鹽還原（ANR）和異化型硝酸鹽還原為銨鹽（DNRA）的遺傳潛力。15N同位素追蹤和動力學實驗驗證了其HN-AD能力，證明了完整的氮去除途徑，包括硝化作用和反硝化作用[NH?? ? 谷氨酰胺?→?NH?OH?→?NO???→?NO??, NO???→?NO???→?NO?→?N?O?→?N?]。氨基酸同位素和氮平衡分析表明，硝酸鹽還原途徑依賴于環境條件：在低C/N比時反硝化（氮損失）占主導，而在高C/N比時同化/異化型硝酸鹽還原（氮保留）占主導。轉錄組分析顯示，通過抑制硝酸鹽轉運和還原作用，該菌株優先利用銨鹽，表明存在氮利用的層次結構和生態位適應。在水產廢水處理中，An-6在6小時內實現了96.1%的NH??和93.3%的NO??去除，顯示出其在處理高氮廢水中的潛力。微生物群落分析證實了其相對于本地菌群的競爭優勢。本研究將HN-AD細菌的理解從純培養擴展到了微生物群落層面，首次直接證明了單一細菌能夠完成反硝化、ANR、DNRA、硝化和銨鹽同化，為氮去除提供了一種有效且簡潔的策略。
引言
由于人為氮輸入的增加，主要來自工業廢水、農業徑流和城市廢水中的銨鹽（NH??）和硝酸鹽（NO??），淡水、沿海和海洋生態系統中的氮負荷顯著增加，改變了氮的生物地球化學循環。這些變化加劇了生態威脅，如有害藻類爆發、缺氧和生物多樣性喪失（Cheng等人，2020；Duce等人，2008；Galloway等人，2008；Ren等人，2017）。傳統的生物氮去除方法需要不同微生物類群之間的代謝協作：自養氨氧化細菌/古菌（AOB/AOA）將NH?轉化為NO??，亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）進一步將NO??氧化為NO??，而專性反硝化細菌在無氧條件下將NO??還原為N?（Kuypers等人，2018；Stein和Klotz，2016）。然而，這些功能群對環境和底物條件的適應性不同，導致在自然和工程系統中形成不同的生態位劃分（Han等人，2024；Mosley等人，2022；Roothans等人，2025）。因此，傳統的廢水處理過程（如A2O工藝）受到高運行成本、自養硝化菌生長緩慢和硝化速率低以及環境波動的影響（Liu等人，2010）。
異養硝化-好氧反硝化（HN-AD）通過在一個細菌體內整合硝化和反硝化過程，從根本上突破了這一傳統模式（Yao等人，2013；Zhang等人，2012）。單一HN-AD菌株同時去除NH??和NO??，為氮管理提供了一種更靈活高效的方法。此外，異養代謝和完全的好氧反硝化支持快速細胞生長、高氮去除率，并減少了中間產物的積累（Yang等人，2015；Yao等人，2013）。盡管有這些優勢，尤其是在降低能量需求和過程復雜性方面，但人們對HN-AD細菌如何協調不同的氮氧化還原反應的機制理解仍不完整（Xi等人，2022）。大多數關于HN-AD菌株的研究主要通過測量亞硝酸鹽/硝酸鹽積累并基于氮平衡計算估算總氮損失（N?）來驗證其硝化和反硝化功能（Cui等人，2021；Duan等人，2015；Hu等人，2024；Wang等人，2023a）。然而，硝酸鹽/亞硝酸鹽的短暫或無法檢測的水平、同化貢獻以及氣體損失常常掩蓋了準確的評估（Cui等人，2021；Duan等人，2015；Zhang等人，2012）。特別是，在大多數異養氨氧化細菌中，銨鹽同化是另一種主要的氮去除途徑，通常占總氮去除通量的近一半或更多（Wu等人，2021；Zhang等人，2026）。盡管如此，其在HN-AD研究中的貢獻仍然被低估和忽視，阻礙了對這些細菌氮代謝網絡的全面理解。其他研究通過針對硝化（amoA, hao）和反硝化（napA/B, narG/H, nosZ）的標志性基因來表征HN-AD途徑（Ke等人，2022；Wu等人，2024）。然而，基因組調查顯示，許多HN-AD菌株缺乏這些基因的完整集合（Cui等人，2021；Wu等人，2024）。值得注意的是，越來越多的異養氨氧化細菌（如Alcaligenes faecalis）被報道能夠氧化銨鹽和羥胺（NH?OH），即使缺乏hao和amoA，這表明可能存在未知基因或替代途徑（Qin等人，2024；Qiu和Liu，2025；Yang等人，2025；Lei等人，2025；Zhao等人，2012）。HN-AD菌株的生理和功能仍尚未完全闡明。
除了其代謝優勢和應用潛力外，HN-AD細菌還被認為是在變異性氮豐富生境中的關鍵硝化或反硝化微生物，如活性污泥、沉積物和濕地（Chen等人，2024；Duan等人，2015；Lin和Shieh，2006；Ouyang等人，2020；Zhang等人，2022）。這些環境的特點是氧氣、pH值和營養水平的變化劇烈或頻繁，有利于具有強大環境適應性的微生物在氮氧化和還原過程之間無縫切換。然而，HN-AD細菌繁衍的生態位以及它們如何在變化條件下優先處理和調節多種氮底物（如NH??、NO??）仍知之甚少。解碼這種氮代謝策略對于理解動態生態系統中的微生物競爭以及設計最大化氮去除同時最小化N?O等中間產物的生物技術至關重要。
Zobellella屬菌株因其在波動環境中的普遍存在而受到關注，例如海岸沙子、海灘沉積物和河口紅樹林，這些地方的氮和氧氣可用性變化很大（Lee等人，2018；Li等人，2024；Lin和Shieh，2006；Zhao等人，2022）。這種生態廣度表明Zobellella可能在過渡帶驅動多種氮物種的氧化還原轉化，加速氮的循環并超越生長較慢的自養硝化菌和嚴格厭氧反硝化菌。然而，支持這種生態位適應的代謝策略仍 largely 未知，限制了其在生態模型或工程系統中的整合。
在這項研究中，我們報告了一種新型HN-AD菌株Zobellella sp. An-6的分離和特性分析，該菌株在廣泛的pH值、溫度、C/N比和鹽度范圍內無需控制氧氣梯度即可去除NH??-N和NO??-N。通過整合生理測定、動力學研究、全基因組分析、15N同位素追蹤和轉錄組分析，我們揭示了其多功能氮代謝途徑和調控機制。我們進一步評估了其在高濃度NH??和NO??廢水中的氮去除性能和競爭優勢，證實了其在廢水處理中的應用潛力。
部分摘要
培養基
富集培養基（EM）：1 g/L (NH?)?SO?，1.5 g/L NaNO?（氮），25 mg/L，5 g/L Na?C?H?O?·6H?O，0.2 g/L MgSO?·7H?O，1 g/L KH?PO?，微量元素溶液（100倍）10 mL/L。
異養硝化培養基（HNM）：0.236 g/L (NH?)?SO?（氮），50 mg/L，2.81 g/L Na?C?H?O?·6H?O（碳），500 mg/L，0.2 g/L MgSO?·7H?O，5 g/L Na?HPO?·12H?O，1.3 g/L KH?PO?，微量元素溶液（100倍）10 mL/L，pH 7.0。
反硝化培養基（DM）：0.304 g/L NaNO?（氮），50 mg/L，2.81 g/L Na?C?H?O?·6H?O（碳），500 mg/L，0.2 g/L MgSO?·7H?O，
An-6的鑒定和全基因組分析
通過使用SNAD培養基進行系列傳代培養，從瓊脂平板上分離出五個形態不同的菌落。其中，An-6菌株表現出同時去除硝酸鹽和銨鹽的卓越能力。16S rRNA基因的系統發育分析將An-6歸類為Zobellella屬，與Z. denitrificans F13-1的相似度最高（99.6%），其次是Z. denitrificans ZD1T（99.06%）、Z. aerophila JC2671T（97.49%）、Z. maritima 102-Py4T（96.70%）等。
討論
在這項研究中，從受油污染的土壤中分離出一種新型兼性厭氧HN-AD細菌Zobellella sp. An-6。該菌株在廣泛的C/N比（2–20）、溫度（15–35°C）和鹽度范圍（1–5%）下表現出同時去除銨鹽和硝酸鹽的強大能力。基因組和轉錄組分析揭示了一個復雜的氮代謝基因網絡，包括反硝化、ANR、DNRA、硝化和銨鹽同化。這些共同使
結論
我們的發現加深了對單個細菌如何獨立協調硝化、反硝化和銨鹽同化的理解，克服了嚴格自養和厭氧菌的局限性。Zobellella sp. An-6結合了多功能的氮代謝、快速生長率和強大的環境適應性，使其成為一種有前景的
數據可用性
本研究的所有原始數據，包括An-6的基因組組裝、擴增子測序和轉錄組測序，已存放在國家生物技術信息中心（NCBI）的BioProject訪問號PRJNA1222198下。
CRediT作者貢獻聲明
姚順：撰寫——初稿，方法學，調查，正式分析，數據管理，概念化。胡楚曉：驗證。歐宣：調查。修琪：調查。何紅林：調查。侯亞漢：調查。張新瑞：調查。馬婷：監督。顧吉東：撰寫——審閱與編輯。夏文杰：撰寫——審閱與編輯，概念化，監督。
CRediT作者貢獻聲明
姚順：撰寫——初稿，調查，正式分析，數據管理，概念化。胡楚曉：驗證。歐宣：調查。修琪：調查。何紅林：調查。侯亞漢：調查。張新瑞：調查。馬婷：監督。顧吉東：撰寫——審閱與編輯。夏文杰：撰寫——審閱與編輯，監督，資金獲取，概念化。利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文工作的財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了天津市杰出青年科學家科學基金（24JCJQJC00120）和中國國家重點研發計劃（2020YFC1808803）的支持。
