《Scientific Reports》：Validation and application of a standardized quantitative PCR assay for the assessment of antimicrobial resistance genes in surface water
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為應(yīng)對環(huán)境中抗生素抗性基因（ARGs）監(jiān)測缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法的問題，研究人員針對地表水樣本，開展了一項涵蓋47個細(xì)菌基因靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化定量PCR（qPCR）檢測方案的驗證與應(yīng)用研究。結(jié)果顯示，該qPCR方案在靈敏度和特異性方面表現(xiàn)優(yōu)異，并成功在阿拉斯加三個國家公園的地表水中檢測到19種ARGs，其豐度與人類活動強(qiáng)度相關(guān)。此研究為環(huán)境水體，包括受人類影響極小水體的ARGs監(jiān)測，提供了可靠工具。
在碧波蕩漾的江河湖泊中，一場肉眼看不見的“軍備競賽”正悄然進(jìn)行。對抗生素產(chǎn)生抵抗能力的細(xì)菌不斷進(jìn)化，其攜帶的抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）在環(huán)境中傳播，不僅可作為人為污染的一項指標(biāo)，更對公眾健康構(gòu)成了潛在的長期威脅。然而，在廣闊的江河湖海中，精準(zhǔn)、高效地“追蹤”這些微小的抗性基因并非易事。當(dāng)前，對環(huán)境中的抗生素抗性進(jìn)行表征缺乏統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的方法，這如同在沒有統(tǒng)一度量衡的情況下試圖繪制一幅精確的地圖。為了解決這個難題，研究人員將目光投向了一種在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的技術(shù)——定量PCR（quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）。這項技術(shù)能夠快速、靈敏地檢測特定基因序列，是監(jiān)測環(huán)境水體中ARGs的有力候選工具。但問題隨之而來：一個為環(huán)境水體樣本量身定制的qPCR檢測方案，其可靠性究竟如何？能否在不同條件下穩(wěn)定地“捕捉”到目標(biāo)基因？更重要的是，在那些我們認(rèn)為是“原始”和“未受污染”的自然水域中，ARGs的真實分布情況又是怎樣的？為了解答這些疑問，一項聚焦于地表水ARGs監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)化qPCR方法驗證與應(yīng)用研究應(yīng)運而生，其成果最終發(fā)表于《Scientific Reports》。
研究人員開展此項研究，主要運用了幾個關(guān)鍵技術(shù)方法。首先是標(biāo)準(zhǔn)化的定量PCR（qPCR）技術(shù)，用于快速檢測47個特定的細(xì)菌基因靶標(biāo)，包括多種抗生素抗性基因和16S rRNA基因。其次是全基因組測序（Whole Genome Sequencing, WGS），將其作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，用以評估qPCR檢測方案的靈敏度和特異性。在樣本處理方面，研究采用了超濾（ultrafiltration）技術(shù)，以從大體積地表水（不同體積）中濃縮微生物和核酸。最后，通過向無菌水中添加已知濃度和類型的ARGs（即“加標(biāo)”實驗），來評估qPCR方法在實際水樣基質(zhì)中的檢測能力和回收率。樣本來源于美國阿拉斯加州三個不同游客訪問量的國家公園內(nèi)的六個采樣點。
研究方法驗證與靈敏度評估
研究人員首先建立并驗證了一套針對地表水樣本的qPCR檢測方案，覆蓋47個細(xì)菌基因靶標(biāo)。通過與細(xì)菌分離株的全基因組測序結(jié)果對比，該qPCR方案顯示出優(yōu)異的檢測性能，靈敏度高達(dá)97.66%，特異性達(dá)98.71%，證明了其在識別目標(biāo)ARGs方面的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步的“加標(biāo)”實驗表明，該方案能夠在不同濃度的加標(biāo)和無菌水樣本、以及四種不同超濾體積的條件下，穩(wěn)定檢測出多達(dá)6/8（75.0%）的已知ARGs，驗證了其在復(fù)雜水樣基質(zhì)中的穩(wěn)定性和可靠性。
阿拉斯加國家公園地表水ARGs的實地檢測
利用已驗證的qPCR方案，研究人員對阿拉斯加三個國家公園內(nèi)六個地點的超濾地表水樣本進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，總共檢測到19種不同的抗生素抗性基因，證明了即使在偏遠(yuǎn)地區(qū)的地表水中也存在多樣的ARGs污染。值得注意的是，ARGs的分布并非均勻。在游客訪問量較大的公園內(nèi)，檢測到的獨特ARGs種類更多，暗示了人類活動對環(huán)境中抗性基因庫的影響。具體而言，位于基奈峽灣國家公園出口溪的一個采樣點，其下游緊鄰游客中心，該點位檢測到的ARGs相對于16S rRNA基因的相對豐度，顯著高于所有其他采樣點。這一發(fā)現(xiàn)直接將局部的人類活動強(qiáng)度與環(huán)境中ARGs的負(fù)荷水平聯(lián)系起來。
本研究成功開發(fā)并驗證了一套適用于地表水樣本的、針對多種抗生素抗性基因的標(biāo)準(zhǔn)化定量PCR（qPCR）檢測方案。該方案具有高靈敏度和高特異性，能夠有效評估環(huán)境水體中的ARGs污染狀況。通過對阿拉斯加國家公園的實地應(yīng)用，研究首次系統(tǒng)報告了該地區(qū)原始與半原始地表水中的ARGs分布圖譜，并揭示了人類活動（以游客訪問量為指標(biāo)）是影響這些偏遠(yuǎn)水生環(huán)境中ARGs多樣性與豐度的重要因素。特別地，靠近人類設(shè)施的水體表現(xiàn)出更高的抗性基因負(fù)荷。該研究的意義在于，它提供了一種強(qiáng)大、標(biāo)準(zhǔn)化的工具（robust qPCR assay），使得對包括受人類影響極小水體在內(nèi)的各種地表水進(jìn)行常規(guī)、可比較的ARGs監(jiān)測成為可能。這為科學(xué)評估環(huán)境抗生素抗性這一新興污染物的分布、傳播及生態(tài)與健康風(fēng)險奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，對環(huán)境保護(hù)和公共衛(wèi)生管理具有重要價值。
