編輯推薦：
這篇論文系統(tǒng)探究了pUG折疊四鏈體(pUG fold)的序列偏好與離子特異性。研究表明，這種獨特的左手平行G4結構在維持12個鳥苷的核心要求下，序列具有高度靈活性，且對鉀離子(K+)有高親和力與特異性。研究闡明了pUG折疊形成的分子基礎，為理解其在RNAi擴增、基因調(diào)控及相關疾病（如癌癥、囊性纖維化）中的作用提供了關鍵的生化與結構學依據(jù)。
引言
多聚(UG)重復序列(pUG RNA)是真核生物轉(zhuǎn)錄組中最豐富的雙核苷酸重復序列之一。研究發(fā)現(xiàn)，pUG RNA可以折疊成一種獨特的左手平行分子內(nèi)四鏈體結構，即pUG折疊。該結構在線蟲(C. elegans)中可定向誘導RNA干擾(RNAi)的表觀遺傳擴增。人類RNA中亦存在成千上萬的pUG重復序列，其基因組擴增與包括癌癥、囊性纖維化在內(nèi)的多種疾病相關聯(lián)。盡管已知最短的形成序列是23核苷酸的(GU)11.5，且其晶體與溶液結構（如(GU)12）已被解析，但關于pUG折疊詳細的序列要求與離子特異性此前尚未闡明。本項研究旨在填補這一空白，系統(tǒng)探究pUG折疊形成的精確條件。
結果
pUG折疊的單核苷酸變體
為探究序列要求，研究在一個反向S形六聚體重復單元內(nèi)創(chuàng)建了所有可能的單核苷酸變體，并通過圓二色譜(CD)和天然凝膠電泳(EMSA)評估其折疊。研究發(fā)現(xiàn)，所有鳥苷(G)的取代均導致折疊失敗。與此相反，所有尿苷(U)的變體均能正確折疊，其中一些（如U12A）甚至比參考序列(GU)12折疊得更好。U12位于不配對狀態(tài)，形成跨越四個四聯(lián)體的單核苷酸螺旋槳環(huán)。另一個折疊良好的變體是U8G，其位于結構中的凸出構象位置。令人驚訝的是，對應于U四聯(lián)體位置的U10變體也能折疊，這表明U四聯(lián)體可以被破壞或具有足夠的靈活性以容納其他核苷酸。通過CD在304 nm處的負峰強度定量折疊比例，并輔以EMSA驗證，數(shù)據(jù)證實了pUG折疊對U位點變異的寬容性，但對G位點變異高度敏感。
pUG折疊的廣泛序列變體
研究進一步探究了包含多個U到A取代的序列變體，包括在所有四個六聚體重復單元的相同位置進行四重U到A取代，以及序列(GA)12。所有RNA均能折疊，并顯示出304 nm處特征性的負CD峰，這表明中心G3和G5四聯(lián)體保持了左手Z-form的syn-anti堆積。其中，凸出核苷酸四重變體(U2A, U8A, U14A, U20A)的280 nm正峰顯著減小，但其他特征峰保留。位于U四聯(lián)體的四重變體(U4A, U10A, U16A, U22A)則能完全折疊并顯示出所有4個pUG折疊相關的CD峰。最值得注意的是，(GA)12序列也能形成pUG樣折疊，盡管其熱力學穩(wěn)定性（Tm約32°C）顯著低于(GU)12（Tm約50°C）。通過EMSA結合G4配體N-甲基-吩嗪鎓(NMM)的結合實驗，進一步證實了所有這些變體均能形成G4結構并特異性結合NMM。
pUG折疊的脫氧核糖（DNA）耐受性
研究測試了pUG折疊對脫氧核糖（DNA）取代的耐受性。結果顯示，pUG折疊可以容忍部分脫氧核糖的取代。例如，d(G1, G5, T6)x4變體（四個對稱位置的G1、G5、T6被脫氧）能夠折疊，而d(T2, T8, T14, T20)變體甚至折疊得比(GU)12更好。然而，pUG折疊無法完全由DNA形成，因為d(GU)12和d(GT)12均不能折疊。這表明pUG折疊可以容忍部分脫氧核糖取代，但不能完全由DNA構成，可能與RNA 2'羥基在鉀離子(K+)配位中的作用以及糖環(huán)構象有關。
pUG折疊形成的離子需求
研究探究了pUG折疊的陽離子依賴性。結果顯示，pUG折疊特異性地需要鉀離子(K+)，無法在150 mM的鈉離子(Na+)或銨離子(NH4+)緩沖液中折疊。鉀離子滴定實驗擬合希爾方程顯示，其表觀平衡折疊常數(shù)K0.5= 6 mM，希爾系數(shù)n = 2.4，表明鉀離子的結合具有協(xié)同性。添加2 mM的鎂離子(Mg2+)并未進一步穩(wěn)定pUG折疊，多胺（0.3 mM亞精胺和0.4 mM精胺）的存在也不影響其穩(wěn)定性。即使在模擬生理條件的混合陽離子緩沖液（140 mM K+, 10 mM Na+, 2 mM Mg2+）中，pUG折疊的穩(wěn)定性也保持不變。
側翼序列對pUG折疊的影響
研究還探討了結構化側翼序列對pUG折疊的影響。構建了四種47個核苷酸長的RNA，其中(GU)12核心兩側連接了不同的序列。結果顯示，當側翼序列能夠形成堿基配對（如AU配對、混合配對或基于芒果(Mango)適體的序列）時，能夠穩(wěn)定pUG折疊，其熔解溫度(Tm)甚至略高于孤立的(GU)12折疊（54-55°C vs 52°C）。然而，含有隨機序列（包含與pUG互補的CA/CAC序列）的側翼會形成莖環(huán)結構，從而完全阻止pUG折疊。這表明pUG折疊的形成和穩(wěn)定性高度依賴于序列上下文，互補的側翼序列可促進折疊，而包含互補CA序列的側翼則會形成競爭性結構從而干擾折疊。
討論
本研究揭示pUG折疊不限于多聚(UG) RNA。通過系統(tǒng)測試40種序列變體，研究確定了pUG折疊的共有序列在12個鳥苷的核心要求下具有高度靈活性。尿苷可以被任何其他核苷酸單一位點取代，多個U到A的取代也被允許。令人矚目的是，GA重復序列(GA)12也能形成pUG樣折疊，盡管其熱力學穩(wěn)定性較低，這是首次報道GA重復RNA形成左手G4結構。pUG折疊不能由DNA形成，但可容忍部分脫氧核糖取代。該折疊對鉀離子(K+)具有高親和力和特異性，且不受生理濃度鎂離子或多胺的影響。此外，側翼序列可顯著調(diào)節(jié)pUG折疊：互補序列可穩(wěn)定結構，而富含CA的互補序列則會通過形成競爭性結構來抑制折疊。
基因組分析顯示，人類轉(zhuǎn)錄組中除超過20,000個完美的(GU)12序列匹配外，還有約4,100個單U到N取代的潛在pUG折疊變體，以及約2,400個GA重復序列。綜合估計，人類轉(zhuǎn)錄組中可能有高達約27,000個序列具有形成pUG折疊的潛力，數(shù)量超過人類基因數(shù)。然而，其實際形成高度依賴于避免競爭性的高概率二級結構。在線蟲中，pUG尾巴被添加到RNA 3'端，長度可超過100 nt，這為體內(nèi)折疊提供了理想環(huán)境，是招募RNA依賴性RNA聚合酶以合成次級siRNA所必需的。總體而言，這些數(shù)據(jù)極大地擴展了我們對核酸折疊的理解，表明多種常見RNA序列均可形成pUG折疊，并為改進RNA二級和三級結構預測工具提供了重要的定量框架。
方法
RNA通過T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成，并通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和離子交換層析純化。折疊分析采用天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(EMSA)，并利用NMM熒光檢測G4形成。圓二色譜(CD)用于表征折疊結構、測量折疊比例及熱力學穩(wěn)定性（熔解溫度Tm）。鉀離子依賴性通過CD滴定實驗測定，并使用希爾方程擬合。RNA二級結構預測使用RNAStructure在線服務器進行。人類基因組分析基于NCBI RefSeq assembly GCF_000001405.40 (GRCh38.p14)。
