膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus）是臨床上重要的非結(jié)核分枝桿菌（NTM）病原體之一，因其對(duì)大多數(shù)一線抗分枝桿菌藥物具有廣譜耐藥性，導(dǎo)致治療極其困難，治愈率估計(jì)低于50%。目前的治療方案通常需要持續(xù)18至24個(gè)月的聯(lián)合療法，因此亟需改進(jìn)治療策略。近年來(lái)，噁唑烷酮類抗生素利奈唑胺（linezolid）被證明在治療膿腫分枝桿菌感染時(shí)能改善臨床結(jié)局，并已被納入世界衛(wèi)生組織的多藥耐藥結(jié)核病治療指南。鑒于膿腫分枝桿菌治療選擇有限，而利奈唑胺具有納入治療方案的潛力，更好地理解其在該菌中的耐藥機(jī)制至關(guān)重要。

細(xì)菌獲得耐藥的途徑眾多。其中，對(duì)核糖體結(jié)合抗生素的耐藥性涉及一個(gè)日益被認(rèn)識(shí)的機(jī)制——F亞型ATP結(jié)合盒（ABC-F）蛋白。ABC超家族是一個(gè)古老的多樣化蛋白家族，遍布所有生命界。ABC-F家族蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，直接結(jié)合核糖體并調(diào)節(jié)其功能，而非跨膜運(yùn)輸分子。其中，多個(gè)ABC-F家族蛋白通過(guò)結(jié)合核糖體來(lái)減輕靶向大核糖體亞基的抗生素對(duì)翻譯的抑制，從而賦予抗生素耐藥性（ARE）。ARE-ABC-F蛋白根據(jù)其賦予耐藥性的抗生素分為三組：PLS_A（抗截短側(cè)耳素、林可酰胺和A型鏈陽(yáng)霉素）、MS_B（抗大環(huán)內(nèi)酯和B型鏈陽(yáng)霉素）以及PhO（抗苯丙醇類[如氯霉素]和噁唑烷酮類[如利奈唑胺]）。在結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中，OcrA（Rv1473）被證實(shí)是一種賦予利奈唑胺耐藥的ARE-ABC-F PhO蛋白。這些線索促使研究者探究膿腫分枝桿菌的利奈唑胺耐藥是否部分由ABC-F家族蛋白驅(qū)動(dòng)。

通過(guò)氨基酸序列同源性搜索發(fā)現(xiàn)，膿腫分枝桿菌基因MAB_2736c與結(jié)核分枝桿菌的ocrA（Rv1473）具有84%的序列同一性。利用AlphaFold預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與結(jié)核分枝桿菌OcrA的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)以及糞腸球菌（Enterococcus faecalis）PoxtA的X射線晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示MAB_2736c與OcrA的均方根偏差（RMSD）為1.709 ?，支持其歸類為ABC-F家族蛋白。

為確定MAB_2736c是否在利奈唑胺耐藥中發(fā)揮作用，研究者在膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19977）中使用了脫水四環(huán)素（ATc）誘導(dǎo)的Cas9/CRISPRi系統(tǒng)。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)敲低MAB_2736c后，細(xì)菌對(duì)利奈唑胺的敏感性增加。這些數(shù)據(jù)表明，MAB_2736c很可能是一種ARE-ABC-F蛋白，并可能發(fā)揮類似于OcrA和其他PhO蛋白的抗生素耐藥作用。

盡管上述結(jié)果表明缺失MAB_2736c會(huì)使膿腫分枝桿菌對(duì)利奈唑胺更敏感，但這種效應(yīng)可能是敲低MAB_2736c后下游間接翻譯缺陷所致。為了評(píng)估MAB_2736c是否能主動(dòng)調(diào)節(jié)利奈唑胺效力，研究者接下來(lái)檢測(cè)了過(guò)表達(dá)MAB_2736c是否會(huì)賦予更高的利奈唑胺耐藥性。在膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中組成型過(guò)表達(dá)MAB_2736c，足以提高對(duì)利奈唑胺的耐藥水平。為了確定這種效應(yīng)是否在分枝桿菌中普遍存在，研究者也在非致病性的恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）中表達(dá)了MAB_2736c。過(guò)表達(dá)MAB_2736c同樣使恥垢分枝桿菌對(duì)利奈唑胺的耐藥性顯著增加，這表明MAB_2736c足以通過(guò)一種在分枝桿菌中普遍適用的機(jī)制產(chǎn)生利奈唑胺耐藥。

為了評(píng)估MAB_2736c在標(biāo)準(zhǔn)菌株之外的臨床相關(guān)性，研究者檢測(cè)了利奈唑胺耐藥的膿腫分枝桿菌臨床分離株在核糖體耐藥位點(diǎn)以及MAB_2736c編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的序列變異。在幾個(gè)分離株中檢測(cè)到rrl（23S rRNA）和rplD（核糖體蛋白L4）存在非同義突變，但這些變異與整個(gè)隊(duì)列的耐藥水平并不對(duì)應(yīng)。沒有單一的核糖體變異能解釋觀察到的表型差異。值得注意的是，MAB_2736c編碼序列中未觀察到非同義序列變異。基因上游區(qū)域（定義為起始密碼子上游300 bp，包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）在不同菌株間表現(xiàn)出高度的序列保守性。啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)觀察到的多態(tài)性與利奈唑胺最低抑菌濃度（MIC）值無(wú)關(guān)，但與核糖體位點(diǎn)類似，具有亞種特異性。這一小樣本量的結(jié)果不支持MAB_2736c編碼區(qū)或啟動(dòng)子多態(tài)性是所分析臨床分離株中利奈唑胺耐藥的決定因素，相反，觀察到的變異反映了亞種特異性差異。

所有先前表征的ARE-ABC-F蛋白都對(duì)靶向核糖體50S亞基的特定抗生素子集提供耐藥性。與此一致，MAB_2736c敲低誘導(dǎo)了對(duì)氯霉素的敏感性增加，氯霉素的效應(yīng)也受OcrA和其他PhO ARE-ABC-F蛋白的調(diào)節(jié)。出乎意料的是，MAB_2736c敲低也誘導(dǎo)了對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素和克拉霉素的敏感性增加。這是一個(gè)值得注意的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠渌鸓hO ARE-ABC-F蛋白（如PoxtA和OptrA）不會(huì)改變對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的敏感性。然而，早期當(dāng)OcrA被認(rèn)為是ABC跨膜藥物外排蛋白時(shí)，研究表明結(jié)核分枝桿菌中的ocrA（rv1473）突變體也對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類敏感性增加。

為了區(qū)分這些可能性，研究者檢測(cè)了MAB_2736c敲低是否影響對(duì)通過(guò)30S亞基靶向翻譯的抗生素（阿米卡星和替加環(huán)素）以及靶向DNA（氧氟沙星）或細(xì)胞壁合成（亞胺培南）的抗生素的敏感性，這些抗生素預(yù)計(jì)不受傳統(tǒng)PhO ARE ABC-F蛋白作用的影響。MAB_2736c敲低并未改變對(duì)這些抗生素的敏感性，這表明MAB_2736c特異性地保護(hù)細(xì)菌免受靶向50S亞基的翻譯抑制劑的影響，類似于其他PhO ARE-ABC-F蛋白。然而，觀察到的更廣泛的保護(hù)范圍（包括大環(huán)內(nèi)酯類）提出了可能性，即MAB_2736c可能通過(guò)一種不同于其他PhO ARE-ABC-F蛋白的獨(dú)特或部分 divergent 機(jī)制發(fā)揮作用。

為了進(jìn)一步表征MAB_2736c表達(dá)對(duì)核糖體功能的機(jī)制性影響，研究者在利用大腸桿菌（Escherichia coli）來(lái)源核糖體的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)中評(píng)估了MAB_2736c對(duì)翻譯的影響。研究者同時(shí)表達(dá)了熒光報(bào)告蛋白mNeonGreen以及MAB_2736c或?qū)φ盏鞍祝ù竽c桿菌二氫葉酸還原酶，DHFR）。在無(wú)藥物條件下，與DHFR或無(wú)模板對(duì)照相比，MAB_2736c降低了熒光報(bào)告蛋白翻譯的基線速率，這表明MAB_2736c可能在體外調(diào)節(jié)或干擾大腸桿菌核糖體功能。添加利奈唑胺后，不僅如預(yù)期那樣降低了對(duì)照模板條件下的翻譯速率，在表達(dá)MAB_2736c的條件下也導(dǎo)致了翻譯速率的適度下降。在歸一化至載體對(duì)照（DMSO）以考慮基線差異后，在25 μM利奈唑胺條件下，與DHFR相比，MAB_2736c的表達(dá)與翻譯的相對(duì)保存相關(guān)。這種保護(hù)作用在更高劑量的利奈唑胺下減弱，這與觀察到更高飽和劑量的利奈唑胺能夠抑制膿腫分枝桿菌生長(zhǎng)的結(jié)果一致。

這些結(jié)果與MAB_2736c可以通過(guò)直接核糖體保護(hù)降低翻譯核糖體對(duì)利奈唑胺抑制的敏感性的可能性是一致的。然而，鑒于基線翻譯的降低以及該實(shí)驗(yàn)的異源性本質(zhì)，不能排除其他解釋，例如MAB_2736c部分抑制大腸桿菌核糖體導(dǎo)致對(duì)利奈唑胺敏感性降低。因此，研究者將這些數(shù)據(jù)解釋為支持性證據(jù)，表明MAB_2736c作為候選核糖體保護(hù)因子發(fā)揮作用，有助于膿腫分枝桿菌的利奈唑胺耐藥。需要在同源系統(tǒng)中進(jìn)行更多研究來(lái)確定其在膿腫分枝桿菌中的精確作用機(jī)制。

大量ABC-F蛋白已被證明在多種致病菌中賦予抗生素耐藥性。然而，它們?cè)谥虏⌒苑种�桿菌中的作用在很大程度上仍未得到探索。在這項(xiàng)研究中，研究者提供了遺傳、表型和機(jī)制證據(jù)，將膿腫分枝桿菌中的MAB_2736c歸類為一種候選ARE-ABC-F蛋白，它通過(guò)可能的核糖體保護(hù)機(jī)制，賦予對(duì)利奈唑胺、氯霉素和大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性。

通常，ARE-ABC-F蛋白根據(jù)其賦予耐藥性的抗生素進(jìn)行功能分組。例如，賦予對(duì)利奈唑胺和氯霉素耐藥的ARE-ABC-F蛋白屬于PhO組。然而，與其他PhO ARE-ABC-F蛋白相比，MAB_2736c的表達(dá)也改變了對(duì)其他50S核糖體亞基靶向抗生素（包括大環(huán)內(nèi)酯類）的敏感性。研究者的發(fā)現(xiàn)表明，MAB_2736c可能以與其他PhO蛋白在機(jī)制上不同的方式發(fā)揮作用。這種區(qū)別突顯了需要重新評(píng)估當(dāng)前ARE-ABC-F蛋白的分類系統(tǒng)。此外，研究者發(fā)現(xiàn)即使在無(wú)抗生素壓力下，MAB_2736c的缺失也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)缺陷，這暗示了MAB_2736c除了耐藥性之外，還具有不可或缺的生物學(xué)作用。需要進(jìn)一步研究以了解MAB_2736c如何在基線條件下調(diào)節(jié)翻譯。關(guān)于MAB_2736c如何結(jié)合分枝桿菌核糖體的結(jié)構(gòu) insights 可能有助于闡明MAB_2736c與其他ARE-ABC-F家族蛋白的不同之處，并提供對(duì)其天然功能的 insight。因此，這也有助于為針對(duì)MAB_2736c的靶向藥物設(shè)計(jì)提供信息。

抑制MAB_2736c可能會(huì)增強(qiáng)多種臨床相關(guān)核糖體靶向抗生素的療效。此外，已經(jīng)提出了幾種克服ARE-ABC-F蛋白引起的抗生素耐藥性的途徑；這些包括開發(fā)具有更高核糖體親和力的核糖體靶向藥物以勝過(guò)ABC-F蛋白，以及開發(fā)ABC-F蛋白結(jié)合位點(diǎn)模擬物以抑制核糖體功能從而停滯翻譯。鑒于MAB_2736c對(duì)幾類核糖體靶向抗生素效力的廣泛影響，在膿腫分枝桿菌中應(yīng)用這些方法可能是提高我們靶向細(xì)菌翻譯和對(duì)抗耐藥性能力的有價(jià)值途徑。對(duì)六株利奈唑胺耐藥的膿腫分枝桿菌臨床分離株的分析未發(fā)現(xiàn)MAB_2736c編碼區(qū)或啟動(dòng)子多態(tài)性與利奈唑胺MIC值相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在這個(gè)小隊(duì)列中，MAB_2736c相關(guān)的利奈唑胺耐藥不太可能用該位點(diǎn)的遺傳變異來(lái)解釋，而可能涉及更廣泛的調(diào)控機(jī)制。盡管未檢測(cè)到MAB_2736c序列變異與利奈唑胺耐藥之間的關(guān)聯(lián)，但對(duì)更多樣化的臨床菌株進(jìn)行更大規(guī)模的研究可能會(huì)揭示此處未捕獲的罕見或譜系特異性變異。此類分析超出了本工作的范圍，與體內(nèi)驗(yàn)證一起，將是全面評(píng)估靶向MAB_2736c臨床相關(guān)性所必需的。總體而言，這項(xiàng)工作增進(jìn)了我們對(duì)分枝桿菌中ARE-ABC-F蛋白的理解，并支持了先前觀點(diǎn)，即ARE-ABC-F蛋白可能代表有吸引力的藥物靶點(diǎn)，以增強(qiáng)現(xiàn)有抗生素的效應(yīng)。