《Applied and Environmental Microbiology》：Discovery and functional characterization of endoglucanases from Coptotermes formosanus with enhanced cellulose hydrolysis via yeast surface display
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本文介紹了一項(xiàng)關(guān)于纖維素酶挖掘與改造的前沿研究。研究者從臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）cDNA文庫中鑒定出8種新型內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase, EG），并通過酵母表面展示（Yeast surface display）技術(shù)在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，其中CTEG6酶在30°C下活性最高（約30 U/mg），且在72小時(shí)的活細(xì)胞發(fā)酵中表現(xiàn)最佳，可高效水解CMC-Na、微晶纖維素（MCC）及玉米芯天然纖維素。通過結(jié)構(gòu)建模、分子對接（Flexible induced-fit docking）及定點(diǎn)誘變（Targeted mutagenesis），研究確定了殘基A11、D251和S258是影響底物結(jié)合與催化效率的關(guān)鍵位點(diǎn)。這項(xiàng)研究不僅篩選出具有產(chǎn)業(yè)化潛力的高效生物催化劑，也為通過理性酶設(shè)計(jì)優(yōu)化纖維素轉(zhuǎn)化技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。
緒論：面向可持續(xù)發(fā)展的纖維素生物轉(zhuǎn)化
隨著化石資源的枯竭和環(huán)境問題的加劇，尋找可再生原料來合成高性能、環(huán)境友好的聚合物變得日益緊迫。由植物光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)聚合物是地球上最豐富的可再生資源，年產(chǎn)量估計(jì)可達(dá)1.5 × 1012噸。纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要成分，是其中占比最大的部分。它由超過10,000個(gè)脫水葡萄糖單元組成，可被酶法水解為葡萄糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為各種高價(jià)值化學(xué)品。然而，秸稈和木材中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的剛性緊密結(jié)合結(jié)構(gòu)使得化學(xué)預(yù)處理過程能耗高、成本昂貴。相比之下，微生物降解是一種高效、低成本且環(huán)境友好的替代方案，為可持續(xù)生物轉(zhuǎn)化過程帶來了巨大希望。
纖維素降解依賴于一個(gè)協(xié)同的多組分酶系統(tǒng)，包括內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase, EG）、外切葡聚糖酶（纖維二糖水解酶）和β-葡萄糖苷酶，而非單一的酶。其中，EG通過靶向纖維素纖維的無定形區(qū)，隨機(jī)切割β-1,4-糖苷鍵，縮短聚合物鏈、產(chǎn)生新的鏈末端并釋放可溶性寡糖，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，篩選具有高催化效率和廣譜底物適應(yīng)性的內(nèi)切葡聚糖酶對于天然纖維素的有效生物降解至關(guān)重要。
白蟻是自然界中纖維素材料的重要分解者。它們的纖維素消化依賴于兩個(gè)互補(bǔ)的系統(tǒng)：白蟻?zhàn)陨懋a(chǎn)生的內(nèi)源性纖維素酶及其腸道內(nèi)共生細(xì)菌和原生生物產(chǎn)生的纖維素酶。臺灣乳白蟻?zhàn)鳛橐环N分布廣泛、以強(qiáng)大纖維素降解能力著稱的物種，一直是纖維素降解酶基因研究的重點(diǎn)。釀酒酵母因其對天然生物質(zhì)中固有毒性化合物的顯著耐受性以及其適用于大規(guī)模工業(yè)過程的特性，被認(rèn)為是纖維素降解工程的有潛力的宿主。然而，天然纖維素聚合物體積過大，無法自行穿過酵母細(xì)胞壁。為了克服這一障礙并降低能耗，酵母表面展示技術(shù)被開發(fā)出來，可將異源酶錨定并展示在細(xì)胞壁上。典型的釀酒酵母表面展示系統(tǒng)使用凝集素或絮凝素蛋白作為融合伴侶，將異源酶錨定在細(xì)胞壁上。其中，絮凝素FLO8包含一個(gè)N端絮凝結(jié)構(gòu)域（結(jié)合細(xì)胞壁糖蛋白）和一個(gè)C端糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定區(qū)域（將其束縛在膜和細(xì)胞壁上）。通過將目標(biāo)酶與Flo8融合，研究者已利用絮凝素系統(tǒng)在酵母表面穩(wěn)定展示了多種纖維素分解蛋白。
材料與方法：基因挖掘、表達(dá)與功能驗(yàn)證
研究使用的臺灣乳白蟻樣品于2023年3月30日采集自中國安徽省巢湖市，并由南京白蟻防治研究所提供。從樣品中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，從中鑒定出八個(gè)不同的EG基因序列，命名為CTEGn（n = 1和3–9）。每個(gè)基因包含一個(gè)1299 bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)432個(gè)氨基酸、預(yù)測分子量約47 kDa的蛋白質(zhì)。為了在酵母表面展示這些酶，研究構(gòu)建了一個(gè)基于pCEV-GM1質(zhì)粒的基因表達(dá)盒。該表達(dá)盒包含強(qiáng)啟動子PGK1、分泌信號肽MF.SS、目標(biāo)EG基因以及用于錨定的FLO8片段。通過限制性酶切和連接，將各片段組裝，為每個(gè)EG變體構(gòu)建了兩種表達(dá)形式：用于表面展示的PGK1–MF.SS–CTEGn–FLO8和用作對照的可溶性表達(dá)形式PGK1–MF.SS–CTEGn。研究還通過嵌套PCR對CTEG6編碼序列進(jìn)行了定點(diǎn)誘變，引入了A11S、D251N和S258G突變，構(gòu)建了三重突變體CTEG10。重組質(zhì)粒通過LiAc/SS-DNA/PEG方法轉(zhuǎn)化至釀酒酵母CEN.PK2-1C菌株中。轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR篩選，并經(jīng)過Sanger測序驗(yàn)證。
功能驗(yàn)證包括通過激光共聚焦顯微鏡觀察帶有綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因的表面展示效果。酶活性測定則通過粗酶液與羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）在30°C或50°C下反應(yīng)1小時(shí)，并使用DNS法測定釋放的還原糖量來進(jìn)行。此外，還進(jìn)行了活細(xì)胞發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在含有不同纖維素底物的培養(yǎng)基中評估工程菌株的水解性能。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）測定了不同轉(zhuǎn)化子中EG基因的拷貝數(shù)。為了從結(jié)構(gòu)上探究活性差異的分子基礎(chǔ)，研究使用AlphaFold2預(yù)測了CTEGn的三維模型，并利用AutoDock v4.2.6對代表性CMC-Na片段進(jìn)行了靈活的誘導(dǎo)契合對接模擬，分析了氫鍵、疏水接觸和底物結(jié)合裂隙。
結(jié)果：新型內(nèi)切葡聚糖酶的發(fā)現(xiàn)與性能評估
從臺灣乳白蟻cDNA中成功鑒定了八種新型內(nèi)切葡聚糖酶（CTEG1和CTEG3–CTEG9）。激光共聚焦顯微鏡圖像顯示，GFP報(bào)告蛋白成功定位在細(xì)胞壁，證實(shí)了EG酶在酵母表面的有效錨定。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，表面展示CTEG1的菌株在72小時(shí)時(shí)釋放的還原糖濃度（1.3747 mg/mL）顯著高于僅表達(dá)可溶性CTEG1的對照菌株（1.0714 mg/mL），證明了表面展示策略能顯著增強(qiáng)纖維素降解效率。
在30°C下，粗酶液的活性測定顯示CTEG6的酶活性最高（30.09 U/mg），其次是CTEG9（27.86 U/mg）和CTEG1（21.69 U/mg）。當(dāng)反應(yīng)溫度升至50°C時(shí)，CTEG9的活性顯著提升至35.44 U/mg，超過了其他所有變體。qPCR結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)化子中EG基因的拷貝數(shù)存在差異，表明觀察到的酶活性差異是內(nèi)在催化特性和基因劑量效應(yīng)共同作用的結(jié)果。在72小時(shí)的活細(xì)胞發(fā)酵中，CTEG6菌株再次展現(xiàn)出最高的水解性能，還原糖滴度達(dá)到1.51 mg/mL，因此被選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳酶。
發(fā)酵條件優(yōu)化與天然纖維素降解
研究人員系統(tǒng)評估了表達(dá)CTEG6的工程釀酒酵母菌株的發(fā)酵條件。溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，30°C是最佳條件，在此溫度下菌株的纖維素酶活性最高，細(xì)胞生長與纖維素降解達(dá)到最佳平衡。在30°C下，進(jìn)一步測試了不同初始pH值的影響，結(jié)果顯示pH 6.0條件下，細(xì)胞密度和還原糖產(chǎn)量均表現(xiàn)最佳，分別為OD6005.75和1.41 ± 0.19 mg/mL還原糖。
隨后，研究評估了該工程菌株對更復(fù)雜纖維素結(jié)構(gòu)的降解能力。以微晶纖維素（MCC）為底物時(shí)，CTEG6菌株在整個(gè)發(fā)酵過程中表現(xiàn)出持續(xù)且顯著高于野生型對照的水解活性。當(dāng)使用天然玉米芯粉末作為底物時(shí)，工程菌株在72小時(shí)釋放了高達(dá)0.53 mg/mL的還原糖，并保持了穩(wěn)定的持續(xù)活性。這些結(jié)果證明了表達(dá)CTEG6的酵母能夠在溫和的發(fā)酵條件下高效水解高結(jié)晶度的MCC和復(fù)雜的天然纖維素。
CTEG6卓越催化活性的結(jié)構(gòu)決定因素
在測試的八種EG中，CTEG6水解活性最高，而CTEG4活性最低。為了探究其性能差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究人員使用AlphaFold2對這兩種酶進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)建模。序列比對顯示兩者僅在殘基11、27、251和258處存在差異。結(jié)構(gòu)疊加分析表明，CTEG6和CTEG4具有相同的整體折疊構(gòu)象，僅存在微小的局部偏差。對代表性CMC-Na片段進(jìn)行的柔性誘導(dǎo)契合對接模擬顯示，野生型CTEG6與配體之間形成了八個(gè)氫鍵，而D251N/S258G雙突變體僅形成三個(gè)氫鍵，預(yù)測的結(jié)合自由能分別為-6.93和-6.02 kcal·mol-1。這表明殘基D251和S258對底物結(jié)合和穩(wěn)定至關(guān)重要。此外，對A11S單點(diǎn)突變的建模顯示，氫鍵數(shù)量從八個(gè)減少到四個(gè)，并且D251與底物的相互作用消失，表明第11位殘基影響了D251參與底物結(jié)合所需的局部幾何構(gòu)型。
為了驗(yàn)證這些計(jì)算預(yù)測，研究構(gòu)建了包含A11S、D251N和S258G突變的三重突變體CTEG10，并與野生型CTEG6進(jìn)行了并行比較。粗酶液活性測定顯示，在30°C和50°C下，CTEG10的比活性均顯著低于野生型CTEG6。72小時(shí)的全細(xì)胞發(fā)酵實(shí)驗(yàn)也一致顯示，CTEG10菌株的還原糖產(chǎn)量（1.10 mg/mL）低于野生型CTEG6菌株（1.50 mg/mL）。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共同證實(shí)了殘基A11、D251和S258是CTEG6底物識別和催化效率的關(guān)鍵協(xié)同決定因素。
討論與展望
將纖維素高效解聚為可溶性寡糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為生物基平臺化學(xué)品和聚合物，為工業(yè)、食品和畜牧業(yè)利用可再生生物質(zhì)資源提供了可行的策略。然而，高效內(nèi)切葡聚糖酶的稀缺以及穩(wěn)健表達(dá)和發(fā)酵系統(tǒng)的缺乏阻礙了這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。本研究從臺灣乳白蟻cDNA文庫中鑒定了八種新型內(nèi)切葡聚糖酶，并通過Flo8絮凝素錨定將其成功展示在釀酒酵母表面。這種表面展示策略顯著增強(qiáng)了工程菌株的纖維素水解能力，實(shí)現(xiàn)了在溫和條件下的持續(xù)高效降解和酶重復(fù)利用。其中，CTEG6因其卓越的催化活性、魯棒性和穩(wěn)定性脫穎而出，在30°C和pH 6.0條件下表現(xiàn)最佳，并且對人工和天然纖維素均具有廣泛的底物特異性。
本研究還通過分子對接模擬探索了CTEG6強(qiáng)大水解性能的分子基礎(chǔ)。結(jié)構(gòu)分析結(jié)合定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)，共同確定了殘基A11、D251和S258是CTEG6優(yōu)異活性的關(guān)鍵分子決定因素。這些發(fā)現(xiàn)不僅推進(jìn)了對纖維素酶作用機(jī)制的理解，也為理性酶工程提供了具體靶點(diǎn)和策略。
值得注意的是，新發(fā)現(xiàn)的八種EG表現(xiàn)出不同的熱穩(wěn)定性，這表明除了催化活性之外，熱耐受性和表達(dá)穩(wěn)定性等因素也可能影響工程菌株的發(fā)酵性能。未來的工作將側(cè)重于優(yōu)化發(fā)酵條件和實(shí)施底物預(yù)處理策略以進(jìn)一步提高產(chǎn)量。同時(shí)，對催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行更深入和系統(tǒng)的表征，將有助于闡明結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。此外，整合纖維素結(jié)合模塊和特定粘附蛋白（如寡糖連接蛋白）已被證明可顯著增強(qiáng)酶-底物相互作用和整體水解效率，這為設(shè)計(jì)具有更高活性、底物親和力和工業(yè)適用性的下一代纖維素酶提供了有前景的策略。
盡管本研究針對保守催化基序設(shè)計(jì)的簡并引物策略有效富集了具有內(nèi)切活性的EG，并使下游功能篩選可控，但它不可避免地偏向于發(fā)現(xiàn)經(jīng)典結(jié)構(gòu)的酶，可能遺漏具有新穎或優(yōu)越特性的非經(jīng)典酶。未來的工作將結(jié)合不依賴引物的采樣方法與高通量功能篩選，以捕獲非典型但可能有價(jià)值的催化劑。同時(shí)，為了消除基因拷貝數(shù)變異對比較研究的干擾，計(jì)劃采用靶向基因組整合或在特定位點(diǎn)進(jìn)行CRISPR介導(dǎo)的單拷貝插入，以標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)并實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的工程改造。
總而言之，這項(xiàng)集發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)與工程于一體的綜合性研究，鑒定出CTEG6作為一種用于酵母基纖維素水解的強(qiáng)效內(nèi)切葡聚糖酶，并確定了A11、D251和S258殘基是影響底物結(jié)合和催化的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者。這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了對作用機(jī)制的理解，也為理性酶工程提供了具體目標(biāo)和策略。通過實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)和工業(yè)殘?jiān)蛴袃r(jià)值的寡糖和平臺化學(xué)品更高效的轉(zhuǎn)化，本工作為開發(fā)可擴(kuò)展、環(huán)境影響更小的生物質(zhì)利用生物工藝奠定了基礎(chǔ)。
