《Applied and Environmental Microbiology》：Two ferric uptake regulator proteins in Ralstonia pseudosolanacearum strain OE1-1 function cooperatively in response to the extracellular iron level under ferrous iron-rich conditions
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本研究聚焦于青枯病菌（RSSC）在感染番茄過程中，從缺鐵的土壤環(huán)境進(jìn)入富鐵的宿主根部時(shí)，如何感知和響應(yīng)胞外鐵水平。文章首次揭示了RSSC中存在兩個(gè)鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白（Fur1和Fur2）。研究發(fā)現(xiàn)，在富Fe2+條件下，F(xiàn)ur1和Fur2協(xié)同抑制鐵載體（siderophore）相關(guān)基因的表達(dá)及胞外Fe3+螯合活性，并調(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)和致病力。這提示RSSC可能通過雙Fur蛋白系統(tǒng)精細(xì)調(diào)控鐵獲取，以維持其在作物中的致病力，為理解植物病原菌適應(yīng)鐵環(huán)境變化的機(jī)制提供了新視角。
RSSC基因組包含一個(gè)保守的Fur和一個(gè)額外的非保守Fur
研究團(tuán)隊(duì)在青枯病菌株OE1-1的基因組中鑒定出兩個(gè)基因，fur1(RSc2747) 和 fur2(RSp0247)，分別編碼Fur1和Fur2。通過進(jìn)化樹分析和保守基序比較發(fā)現(xiàn)，RSSC的四個(gè)譜系菌株均含有這兩個(gè)Fur同源物，其中Fur1是與其他伯克霍爾德菌科物種中存在的保守Fur，而Fur2是RSSC及其近緣種所特有的一個(gè)額外旁系同源蛋白。這表明Fur1和Fur2是功能特征不同的蛋白，在RSSC中并存是其物種特征。
Fur1和Fur2在富Fe2+條件下調(diào)控鐵載體相關(guān)基因的表達(dá)
為探究Fur1和Fur2對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，研究者對(duì)OE1-1野生型、fur1缺失突變體（Δfur1）、fur2缺失突變體（Δfur2）以及雙缺失突變體（Δfur1Δfur2）進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq）分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在富Fe2+條件下，Δfur1和Δfur1Δfur2中大量鐵載體生物合成過程相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。具體來(lái)說(shuō)，涉及兩種已知鐵載體micacocidin和staphyloferrin B合成的基因簇表達(dá)均增加。Fur1是主要的阻遏因子，而Fur2在缺乏Fur1的情況下也表現(xiàn)出對(duì)micacocidin基因簇的阻遏作用，兩者協(xié)同抑制鐵載體相關(guān)基因的表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)錄組分析還顯示Fur1和Fur2對(duì)抗性和鞭毛組裝相關(guān)基因的表達(dá)有調(diào)控作用，并可能誘導(dǎo)一些毒力相關(guān)基因（如eps操縱子和egl）的表達(dá)。
Fur1是富Fe2+條件下胞外Fe3+螯合活性的主要調(diào)節(jié)者，F(xiàn)ur2也參與其中
通過體外胞外Fe3+螯合活性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Fur1和Fur2在鐵穩(wěn)態(tài)中的功能。在富Fe2+條件下，野生型OE1-1的胞外Fe3+螯合活性較低。缺失fur2導(dǎo)致活性增加，缺失fur1導(dǎo)致更大幅度的增加，而雙缺失突變體（Δfur1Δfur2）的活性最高。這表明Fur1是維持低水平螯合活性的主要阻遏蛋白，而Fur2也起到了輔助的抑制作用，兩者在富Fe2+條件下共同抑制胞外鐵螯合活性。
Fur1和Fur2冗余地影響多種代謝相關(guān)基因的表達(dá)
轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，有102個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因和20個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因是雙缺失突變體（Δfur1Δfur2）所特有的，表明Fur1和Fur2對(duì)這些基因的表達(dá)具有冗余調(diào)控作用。其中，在Δfur1Δfur2中特異性上調(diào)的基因主要富集于硝酸鹽還原酶活性和硝酸鹽同化等與硝酸鹽代謝相關(guān)的功能。這揭示了Fur1和Fur2冗余地抑制了硝酸鹽代謝相關(guān)基因的表達(dá)，暗示了RSSC中鐵代謝與氮代謝之間存在緊密聯(lián)系。
缺失fur2降低菌株生長(zhǎng)，而同時(shí)缺失fur1和fur2導(dǎo)致更嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷
對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在富Fe2+條件下，Δfur2的生長(zhǎng)速率低于野生型，而Δfur1的生長(zhǎng)速率與野生型相似。值得注意的是，雙缺失突變體（Δfur1Δfur2）的生長(zhǎng)水平遠(yuǎn)低于單缺失突變體。這表明Fur2對(duì)維持OE1-1的適宜生長(zhǎng)水平是必需的，而Fur1對(duì)生長(zhǎng)具有冗余效應(yīng)，二者協(xié)同影響菌株的體外生長(zhǎng)。
Fur1和Fur2共同促進(jìn)OE1-1在番茄植株中的完全致病力
利用番茄植株進(jìn)行的致病力測(cè)定結(jié)果顯示，接種Δfur1或Δfur2的植株，其發(fā)病指數(shù)在接種后4-7天顯著低于接種野生型的植株，但后期逐漸恢復(fù)。而接種雙缺失突變體（Δfur1Δfur2）的植株，其發(fā)病指數(shù)顯著低于單缺失突變體，植株存活率更高，且細(xì)菌在根系中的定殖數(shù)量在接種后6天也顯著更低。這些結(jié)果表明，F(xiàn)ur1和Fur2均能促進(jìn)OE1-1的致病力，并且兩者在維持感染過程中的細(xì)菌種群數(shù)量和完全毒力方面發(fā)揮著協(xié)同作用。研究人員推測(cè)，突變體毒力下降可能與異常升高的鐵螯合活性觸發(fā)植物免疫反應(yīng)有關(guān)，也可能與細(xì)胞內(nèi)過量Fe2+導(dǎo)致的毒性有關(guān)。
討論與展望
綜上所述，本研究揭示了青枯病菌復(fù)合體（RSSC）通過擁有兩個(gè)功能協(xié)同的鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白Fur1和Fur2，來(lái)精細(xì)應(yīng)對(duì)從缺鐵土壤到富鐵宿主根際的環(huán)境轉(zhuǎn)變。在富Fe2+條件下，兩者協(xié)同抑制鐵載體相關(guān)基因的表達(dá)和胞外Fe3+螯合活性，調(diào)控硝酸鹽代謝等多重通路，并最終影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和致病力。其中Fur1發(fā)揮著主要作用，而Fur2提供了次級(jí)或冗余的功能。這兩個(gè)蛋白分屬不同的進(jìn)化支，并具有不同的結(jié)構(gòu)特征，它們的存在可能是RSSC成功侵染宿主的關(guān)鍵特征之一。未來(lái)的研究需進(jìn)一步闡明Fur1和Fur2具體的生化作用機(jī)制，以及其在宿主內(nèi)部環(huán)境中如何響應(yīng)宿主的免疫反應(yīng)，從而為控制這種重要植物病原菌提供新的潛在靶點(diǎn)。
