《Microbiology Spectrum》：Antimicrobial efficacy of Bifidobacterium longum FB1-4 cell-free supernatant against MRSA: insights into mechanisms and food matrix application
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本研究揭示了一種利用長雙歧桿菌FB1-4的無細(xì)胞上清液（CFS）對(duì)抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的新型多靶點(diǎn)策略。該CFS不僅展現(xiàn)出強(qiáng)效抗菌活性（最小抑菌濃度MIC為5.56 mg/mL），并能顯著降低MRSA的生物膜形成、毒力基因表達(dá)（如mecA, hlgC, saeR/S）及群體感應(yīng)系統(tǒng)。在食品基質(zhì)和體內(nèi)模型中均證實(shí)了其卓越的殺菌效果，為開發(fā)天然食品防腐劑和抗耐藥菌感染療法提供了關(guān)鍵見解。
長雙歧桿菌FB1-4的強(qiáng)效抗菌活性
研究表明，從長雙歧桿菌FB1-4中獲取的無細(xì)胞上清液對(duì)三種MRSA菌株（ATCC43300, BNCC 337371, BNCC361194）均展現(xiàn)出顯著的抗菌活性。通過牛津杯法測得的平均抑菌圈直徑在17.70至18.20毫米之間。通過肉湯微量稀釋法測定，其對(duì)MRSA的最小抑菌濃度為5.56 mg/mL。在與臨床常用抗生素萬古霉素的比較中，F(xiàn)B1-4 CFS在2× MIC濃度下8小時(shí)內(nèi)維持了超過80%的殺滅率，顯示出比同等濃度萬古霉素更持續(xù)穩(wěn)定的殺菌效果。在模擬食品基質(zhì)（香腸）的實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)B1-4 CFS在8小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了接近完全的細(xì)菌清除，殺滅率達(dá)到99.99%，而對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量則急劇增加，這凸顯了其作為天然食品防腐劑的巨大潛力。
抗菌成分的初步解析
研究人員對(duì)FB1-4 CFS的抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了探究。在培養(yǎng)初期，其抗菌活性部分依賴于酸性環(huán)境，但隨著時(shí)間的推移，其抑菌效果超越了單純pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，表明其中含有除酸性代謝物外的其他活性成分。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，CFS中的核心抗菌成分具有良好的耐熱性，在121°C高溫處理15分鐘后，仍能保留約90%的活性，這為其在熱加工食品中的應(yīng)用提供了可能。
抑制抗生素耐藥性及生物膜形成
FB1-4 CFS的一個(gè)關(guān)鍵作用是能夠降低MRSA的抗生素耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FB1-4 CFS處理后，MRSA中關(guān)鍵的甲氧西林耐藥基因mecA的表達(dá)量顯著下調(diào)了58.7%。同時(shí)，當(dāng)FB1-4 CFS與甲氧西林聯(lián)用時(shí)，能夠以劑量依賴的方式增強(qiáng)MRSA對(duì)甲氧西林的敏感性，表明CFS可以逆轉(zhuǎn)或削弱MRSA的耐藥表型。
生物膜是MRSA產(chǎn)生持久感染和增強(qiáng)耐藥性的重要因素。本研究表明，F(xiàn)B1-4 CFS能有效抑制MRSA生物膜的形成。在亞抑菌濃度下，CFS能夠使生物膜相關(guān)基因Psmα和Ica的表達(dá)分別降低62.4%和60.7%。通過結(jié)晶紫染色法定量分析，2× MIC的FB1-4 CFS可抑制約70%的生物膜形成，而在4× MIC濃度下幾乎完全抑制。掃描電子顯微鏡圖像直觀地展示了CFS處理如何導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)從致密、完整變得松散、破裂。此外，CFS還能以濃度依賴的方式減少細(xì)胞外多糖（EPS）的產(chǎn)量，進(jìn)一步削弱生物膜的穩(wěn)定性和保護(hù)作用。
基因組與多組學(xué)機(jī)制揭示
對(duì)FB1-4菌株的全基因組測序分析顯示，其基因組大小為2.42 Mb，GC含量為60.24%，編碼2018個(gè)蛋白。基因本體（GO）富集分析提示，該菌株在翻譯、碳水化合物代謝、磷酸化和跨膜運(yùn)輸?shù)确矫婊蜇S富，為其合成和分泌抗菌化合物提供了遺傳基礎(chǔ)。
為了深入闡明FB1-4 CFS的作用機(jī)制，研究結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了398個(gè)差異表達(dá)基因，其中毒力相關(guān)基因如γ-溶血素基因（hlgA, hlgC）和雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因（saeR, saeS）顯著下調(diào)。RT-qPCR驗(yàn)證了saeR和saeS表達(dá)量下降超過80%，hlgC下調(diào)47.8%。KEGG通路富集分析表明，CFS處理影響了MRSA的多種代謝通路，包括微生物代謝、碳代謝、糖酵解/糖異生、TCA循環(huán)以及多種氨基酸的合成與代謝。GO分析進(jìn)一步指出，碳水化合物代謝過程、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位等生物過程受到顯著干擾。
代謝組學(xué)分析在正負(fù)離子模式下共鑒定出669個(gè)差異代謝物，整體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。KEGG通路富集分析揭示，氨基酸代謝（如賴氨酸、色氨酸）、碳水化合物代謝（如果糖-甘露糖代謝）以及群體感應(yīng)通路受到顯著影響。值得注意的是，群體感應(yīng)信號(hào)分子如N-辛酰基-L-高絲氨酸內(nèi)酯和順-2-十二碳烯酸的含量發(fā)生變化，這與表型觀測中毒力因子受抑制的結(jié)果相吻合。
干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)與毒力因子表達(dá)
群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌協(xié)調(diào)群體行為（包括毒力因子表達(dá)）的關(guān)鍵機(jī)制。研究表明，F(xiàn)B1-4 CFS能有效干擾MRSA的群體感應(yīng)系統(tǒng)。在亞抑菌濃度下，CFS完全抑制了MRSA蛋白酶在脫脂牛奶平板上的水解活性。溶血實(shí)驗(yàn)表明，CFS處理能使MRSA的溶血活性降低65.6%至72.3%。此外，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)CFS處理的MRSA菌落擴(kuò)散能力受到明顯限制。這些結(jié)果綜合表明，F(xiàn)B1-4 CFS通過抑制群體感應(yīng)，多方位削弱了MRSA的致病能力。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效性
研究最后在小鼠體內(nèi)模型中驗(yàn)證了FB1-4 CFS的效果。通過灌胃建立MRSA腸道定植模型后，使用FB1-4 CFS進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，治療組小鼠結(jié)腸中的MRSA定植量比對(duì)照組顯著降低了95.41%。雖然兩組小鼠血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但治療組小鼠的體重下降趨勢更為緩和，整體生理狀況更好。這證明了FB1-4 CFS在復(fù)雜的生物體內(nèi)環(huán)境中仍能有效減少M(fèi)RSA負(fù)荷，具有潛在的治療應(yīng)用前景。
結(jié)論與展望
本研究系統(tǒng)揭示了長雙歧桿菌FB1-4的無細(xì)胞上清液通過多靶點(diǎn)、多機(jī)制的協(xié)同作用，有效對(duì)抗MRSA。其作用包括：直接的殺菌活性；降低mecA基因表達(dá)，增強(qiáng)抗生素敏感性；抑制生物膜形成及相關(guān)基因表達(dá)；通過下調(diào)SaeR/S雙組分系統(tǒng)及干擾群體感應(yīng)，全面抑制溶血素、蛋白酶等毒力因子的產(chǎn)生；并深刻影響MRSA的核心代謝網(wǎng)絡(luò)。這種多管齊下的作用模式有助于規(guī)避單靶點(diǎn)抗生素易產(chǎn)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合其在食品基質(zhì)和體內(nèi)模型中的顯著效果，F(xiàn)B1-4 CFS展現(xiàn)出作為天然食品防腐劑和抗耐藥菌感染新型治療策略的雙重潛力。未來的研究可集中于活性成分的純化與鑒定，并進(jìn)一步開展規(guī)模化制備及臨床前評(píng)估，以推動(dòng)其實(shí)際應(yīng)用。
