《Journal of Plant Interactions》：Endophytic fungi from saline and arid coastal regions: characterization and potential as bioinoculants for crop enhancement
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編者薦語： 本研究從干旱鹽堿海岸帶植物根系分離出415株內生真菌，并篩選出52株，主要成分為暗色有隔內生真菌(DSE)。這些菌株展現出對多種植物病原菌的強拮抗作用(>75%)、無致病性，并能顯著促進番茄等作物幼苗的生物量。它們具備產吲哚-3-乙酸(IAA)、嗜鐵素以及降解淀粉、纖維素、幾丁質等多種酶活性，部分菌株還具有生物膜形成能力。研究揭示了特定內生真菌作為多功能生物接種劑，在應對鹽分和干旱脅迫的可持續農業中的巨大應用潛力。
1. 引言
地中海農業系統正面臨氣候變化帶來的嚴峻挑戰，全球氣溫升高增加了作物的蒸散量和水需求，降水模式的改變和干旱期的延長限制了農業用水的可獲得性。這些氣候變化降低了作物產量和經濟收益，同時病蟲害的頻發導致了對合成農藥的過度依賴，加劇了公共衛生和環境問題。內生真菌，特別是暗色有隔內生真菌(DSEs)，作為增強植物抵抗生物和非生物脅迫的有力盟友，正成為一種有前景的生物技術策略。它們能促進養分吸收、增強植物生長發育，并賦予植物對重金屬、干旱、鹽分等非生物脅迫，以及對多種病原菌等生物脅迫的耐受性。然而，商用微生物制劑的廣泛應用受到兩個主要因素的限制：一是商品化產品中真菌物種的多樣性有限，二是微生物與常規農業實踐（如集約化施肥和化學害蟲防治）的相互作用可能會抑制或掩蓋這些真菌的有益效果。此外，傳統的內生菌分離篩選方法通常會排除那些無法在人工培養基上培養的生物營養型生物，而DSEs作為一類常見于高非生物脅迫環境下的真菌類群，能夠產生分生孢子或微菌核等特化的抗性結構，使其在開發具有長期存活力、滿足微生物產品法規要求的生物制劑方面具有巨大潛力。
2. 材料與方法
2.1. 植物材料與采樣點特征
于2023年2月至7月在西班牙阿爾梅里亞的鹽沼、卡沃德加塔自然公園、阿德拉沿海瀉湖和羅克塔斯德馬爾濕地等多個地點采集植物根系樣品。這些區域因其鹽堿、干旱和半干旱特征而被選中。總共從適應干旱地區的各種已鑒定和未鑒定植物物種中收集了68份根樣，樣品于4℃保存直至處理。
2.2. 內生真菌的分離、純化與保藏
采用改良的表面消毒法從根段中分離內生真菌。將洗凈并切成10-15 mm片段的根樣用5%次氯酸鈉消毒3分鐘，無菌蒸餾水沖洗三次，然后置于添加了氯霉素(100 μg/mL)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上。培養皿于25℃黑暗條件下培養4-10天，每日觀察菌落生長并進行單菌落分離和純化，最終在PDA培養基上于4℃保藏。
2.3. 拮抗菌株篩選試驗
采用平板對峙法，對所有分離株進行體外拮抗15種植物病原菌的能力篩選。病原菌包括多種尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)專化型、瓜類球腔菌(Mycosphaerella melonis)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)等。根據菌絲生長抑制率(PIRG)公式計算結果，并按抑制百分比分為四個等級。
2.4. 真菌分離株鑒定與系統發育分析
首先通過光學顯微鏡(40×)對分離株進行形態學檢查，將其歸類為DSE或非DSE類群。隨后使用引物ITS1和ITS4進行分子鑒定，擴增產物通過BLAST與NCBI GenBank數據庫中的參考序列進行比較，并將驗證后的序列提交至GenBank。使用MEGA 6.0軟件，通過鄰接法進行系統發育分析。
2.5. 真菌分離株致病性測試
為確定所選微生物是否為潛在的植物病原菌，將每種內生菌的菌塊接種到已澆水的蛭石中，并于25℃培養7天。將表面消毒并預發芽的番茄、菜豆和辣椒種子移植到含有菌絲生長基質的500 mL盆缽中。每處理設10個重復，以不接菌的幼苗為對照。從播種后10天開始，每3天目測評估病害癥狀。試驗結束時，測量所有處理的地上部與根系鮮重和干重，并采用墨汁染色法觀察根部定殖情況。
2.6. 植物促生長能力評估
評估了分離株的多種植物促生長性狀：
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IAA (Indole-3-acetic acid) 產生: 通過在添加或不添加L-色氨酸的馬鈴薯葡萄糖液體培養基中培養，使用Salkowski試劑比色法測定培養液中IAA濃度。
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嗜鐵素產生: 采用改良的CAS (Chrome azurol S) 檢測法，通過觀察CAS-藍色培養基中顏色由藍變橙的變化來判斷。
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磷和鉀的溶解: 分別通過在Pikovskaya氏瓊脂（以磷酸三鈣為唯一磷源）和Aleksandrow瓊脂（以長石為唯一鉀源）上培養，測量菌落周圍透明圈直徑來評估。
2.7. 酶活性測定
在改良的Melin-Norkrans (MMN) 瓊脂基礎培養基上，通過添加特定底物并觀察水解圈或顏色變化，評估了各內生菌分離株對木質素、淀粉、脂類、酪蛋白氨基酸、纖維素和幾丁質等復雜物質的降解潛力。測試的酶活性包括：淀粉酶、蛋白酶（以酪蛋白氨基酸為底物）、纖維素酶、漆酶、脂肪酶和幾丁質酶。
2.8. 生物膜形成能力
參照Merritt等方法，通過96孔微孔板結晶紫染色法評估分離株的生物膜形成能力。真菌在PD肉湯中預培養后，轉移至微孔板中培養以促進生物膜發育，經甲醇固定、結晶紫染色、醋酸溶解后，于590 nm波長下測定吸光度。
2.9. 內生真菌對農用化學品的體外耐受性
采用含毒培養基法，評估了所選內生菌與七種商品化殺菌劑的體外相容性。測試了每種活性成分的三種濃度：推薦最低劑量(D1)、推薦最高劑量(D2)和1.5×D2。根據菌絲生長抑制率相對于未處理對照的百分比，參照IOBC (International Organization for Biological Control) 標準將相容性分為無害、輕度有毒、中度有毒和有毒四個等級。
2.10. 數據分析
使用Statgraphics Centurion 19.1.3軟件對數據進行方差分析(ANOVA)，并通過Tukey's HSD檢驗在5%顯著性水平(p<0.05)下進行均值比較。
3. 結果
3.1. 從干旱地區植物根系中分離可培養內生真菌
從68份根樣中共回收了415個真菌分離株。基于形態特征和固體培養基上的生長模式，排除了菌絲過度發育、生長緩慢或缺乏繁殖結構的菌株。最終篩選出52株內生真菌，優先選擇了產孢能力強或能產生微菌核（DSEs典型特征）的菌株用于后續研究。
3.2. 內生真菌對選定植物病原真菌的體外抗真菌活性
52株內生真菌與選定病原菌的拮抗試驗結果顯示，所有真菌內生菌均對至少一種病原菌表現出抗真菌活性。對于快速生長的病原菌（如終極腐霉Pythium ultimum或立枯絲核菌），通常觀察到較低的抑制百分比(<50%)。相比之下，對于生長緩慢的大麗輪枝菌，大多數分離株都記錄到高抑制水平，部分菌株抑制率超過90%。值得注意的是，部分分離株(如BC2、BC12、BC20等)對超過10種不同病原菌的抑制水平均高于75%。基于這些拮抗譜，共篩選出29株內生真菌進入后續實驗階段。
3.3. 內生真菌的ITS鑒定
對50株真菌分離株進行分子鑒定。BLAST分析表明，分離出的內生真菌歸屬于子囊菌門的11個科，以及一個卵菌門的腐霉科(Pythiaceae)。系統發育分析顯示，最具代表性的科是葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)，占24%，單一物種為菜豆殼球孢(Macrophomina phaseolina)。木霉屬(Trichoderma)的T. gamsii和T. saturnisporum (肉座菌科Hypocreaceae)占22%。其他形成明確分支的類群包括Didymellaceae科的物種、糞殼菌(Sordaria fimicola)、球孢黑團孢(Torula spp.)、Clarireedia spp.以及稻黑孢(Nigrospora oryzae)。
3.4. 內生真菌的致病性
在番茄、辣椒或菜豆幼苗上均未觀察到由接種的內生真菌引起的癥狀。接種處理在三種植物物種中導致了生物量生產的高度變異性，但某些菌株產生了有益效應，導致總生物量顯著增加，且這些效應具有宿主特異性。在番茄幼苗中，菌株BC11和BC51分別使總生物量增加了73%和68%。在辣椒幼苗中，除菌株BC50和BC52分別誘導生物量增加67%和79%外，大多數處理的總生物量顯著降低或與對照相當。在菜豆幼苗中，更多菌株表現出對總生物量的顯著生物刺激效應，增幅從80%到140%不等。通過顯微鏡觀察真菌結構，在所有三種宿主物種的根組織內均確認了不同內生菌的存在。
3.5. 真菌內生菌的生物刺激潛力與酶活性評估
29株受測內生真菌在體外條件下表現出與植物促生長相關的不同功能性狀。只有BC17、BC18、BC27、BC30和BC34五個菌株能夠在Pikovskaya氏培養基上溶解無機磷。通過改良CAS檢測法，在29個菌株中的12個中檢測到嗜鐵素產生。所有菌株在有無L-色氨酸條件下均能產生可檢測水平的IAA，其中BC5、BC11和BC24菌株的IAA濃度最高。關于鉀溶解，只有BC20菌株在Aleksandrov培養基中顯示陽性活性。所有菌株的淀粉酶和羧甲基纖維素酶活性均為陽性。對于幾丁質酶活性，BC27和BC34菌株顯示出最高水平。此外，分別有11、8、5和3個菌株對酪蛋白氨基酸、木質素、脂類和酪蛋白的水解呈陽性。
3.6. 生物膜形成能力
29株受測內生真菌的生物膜形成能力差異顯著。一小部分菌株（如BC01、BC27和BC30）表現出較高的生物膜形成能力。相反，幾個菌株顯示出低或可忽略的粘附能力。這種異質性表明，只有一部分內生菌具備在惰性表面上穩定定殖和形成結構化真菌群落的潛力。
3.7. 內生菌-殺菌劑相容性評估
結果揭示了不同殺菌劑對真菌分離株效應的顯著差異。堿式氯化銅、苯菌酮和丙硫菌唑在絕大多數處理中被歸類為無害，表明與所分析真菌分離株的高度相容性。相比之下，嘧菌酯、粉唑醇以及苯醚甲環唑+環氟菌胺的組合主要表現出毒性行為。特別是苯醚甲環唑+環氟菌胺在56%的處理中被歸類為有毒，其余為中度有毒，無害處理為零。粉唑醇在41%的處理中為有毒，59%為中度有毒。嘧菌酯也顯示出高比例的有毒(51%)和中度有毒(49%)處理。此外，一些分離株對處理表現出差異敏感性模式，例如菌株BC12、BC20和BC24在所有測試劑量下均與粉唑醇相容。
4. 討論
適應非生物脅迫條件的微生物的生物勘探和表征，是發展可持續和氣候適應性農業系統的一項基本策略。本研究分離的內生真菌，主要屬于暗色有隔內生真菌(DSEs)類群，代表了適應鹽分和干旱等極端非生物脅迫條件微生物的一個有前景來源。檢測到的高真菌多樣性與來自沙漠和半干旱系統的報告一致，其中DSEs通常形成黑色素化菌絲和微菌核或其他休眠結構，賦予其對干燥、溫度波動和養分缺乏的抗性。這種脅迫抗性繁殖體被認為對于惡劣條件下真菌共生體和生防制劑的持久性和田間表現至關重要。
隨后的有潛力候選菌株篩選基于針對特定植物促生長性狀和抗植物病原菌作用機制的體外試驗。所有分離株均顯示出拮抗活性，其中幾株對諸如大麗輪枝菌等病原菌的抑制水平超過90%。值得注意的是，被鑒定為T. gamsii和T. saturnisporum的分離株表現出廣譜活性，能抑制超過十種不同的病原菌，表明其涉及多種作用模式。這種抑制能力，無論是通過抑制暈圈還是直接對峙檢測到，都與之前將這種反應與抗真菌次生代謝物的分泌以及幾丁質酶、葡聚糖酶和蛋白酶等水解酶的產生聯系起來的報告一致。
在番茄、辣椒和菜豆幼苗上未觀察到致病效應，這支持了其非致病性內生生活方式，并加強了它們作為農業應用安全候選菌株的適用性。此外，幾株菌株顯著增加了植物生物量，特別是在菜豆和番茄中，這表明了可能與吲哚-3-乙酸(IAA)產生和改善養分獲取相關的生物刺激效應。所有分離株均能產生大量IAA（無論有無色氨酸），并顯示出磷酸鹽和鉀的溶解以及嗜鐵素產生——這些是有效的植物促生微生物中常見的關鍵性狀。
從功能角度來看，分離株的酶活性高度多樣化，并且似乎與它們和宿主植物的相互作用緊密相關。淀粉酶、纖維素酶和幾丁質酶的廣泛產生指向了其在底物降解和增強植物防御方面的雙重作用。特別是幾丁質酶，已多次被報道通過降解病原真菌細胞壁而直接抑制它們。此外，一些分離株表現出不太常見但在生態學上相關的活性，如木質素、脂質或酪蛋白氨基酸的降解，拓寬了它們在異質性根際環境中的功能生態位，并有助于養分循環和土壤功能。
生物膜形成在所評估的真菌分離株之間存在顯著差異，甚至在相同屬內也是如此。值得注意的是，在BC01 (Torula sp.)、BC27 (Clarireedia narcissi) 和BC53 (Nigrospora oryzae) 菌株中觀察到了高生物膜形成能力。相比之下，所分析的木霉屬物種均未在實驗條件下形成可檢測的生物膜。生物膜形成與增強根際持久性、改善根表附著以及對不利環境條件的保護有關。因此，產生生物膜的能力也可以作為篩選具有更強定殖能力和在商業制劑中持久性菌株的有價值標準。
雖然許多研究評估了用作生物刺激素或生物防治劑的真菌與農用化學品的相容性或耐受性，但針對暗色有隔內生真菌(DSEs)的此類研究相對較少。DSEs與殺菌劑之間的相容性既取決于活性成分的化學性質，也取決于特定的真菌分離株。本研究中，堿式氯化銅、苯菌酮和丙硫菌唑等化合物通常無毒，而其他活性物質——如嘧菌酯、粉唑醇以及苯醚甲環唑與環氟菌胺的組合——主要表現出毒性效應。這些發現凸顯了評估有益真菌與化學處理之間特定相容性的關鍵需求，因為某些殺菌劑可能會損害微生物接種劑在農業環境中的功效。有趣的是，幾株T. gamsii (BC12, BC20, BC24) 甚至對通常有害的殺菌劑（如粉唑醇）表現出顯著的耐受性，表明它們有可能被整合到綜合管理策略中。
5. 結論
這項初步研究揭示了與干旱環境植物根系相關的內生真菌在分類和功能上的顯著多樣性，涵蓋了子囊菌門11個科和一個卵菌門的代表。所有分離株均對至少一種植物病原菌表現出體外抗真菌活性，其中多個菌株顯示出廣譜和高效抑制。此外，選定的分離株顯著促進了番茄、辣椒和菜豆幼苗的生長，這可能歸因于其產生吲哚-3-乙酸、溶解磷酸鹽和鉀以及合成嗜鐵素的能力。它們多樣化的酶譜——特別是淀粉酶、纖維素酶和幾丁質酶的產生——指向了其在養分循環和植物防御中的雙重作用。觀察到的生物膜形成以及與商品化殺菌劑的可變相容性進一步強調了這些真菌在可持續農業中的生物技術潛力。然而，殺菌劑耐受性的異質性凸顯了在將其整合到農用化學品方案之前進行菌株特異性相容性評估的必要性。總體而言，研究結果支持這樣的觀點：來自干旱生態系統的內生菌是有前景的生物接種劑，可在非生物脅迫下增強作物生產力和恢復力，盡管仍需要田間規模的驗證和對其生物活性化合物的詳細表征，以實現其實際應用。
