《Bioresource Technology》：Triazine-induced extracellular polymeric substance disruption drives metabolic reprogramming and enhanced volatile fatty acid production in anaerobic sludge fermentation
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本研究發現，三嗪類抗生素在低濃度下可顯著增強污泥厭氧發酵中揮發性脂肪酸（VFAs）的產率，最高達1771 mg COD/L（較對照組增加18.4倍）。機制分析表明，三嗪通過破壞EPS中的蛋白質結構，釋放更多底物促進乙酸生成，同時引發微生物群落重組及代謝重編程，包括激活群體感應系統。這些結果揭示了抗生素在特定濃度下通過EPS介導的代謝重編程機制促進資源回收的潛在途徑。
Jingyang Luo|Shumeng Yang|Qian Feng|Xiang Zou|Yang Wu|Feng Wang
教育部淺水湖綜合調控與資源開發重點實驗室，河海大學環境學院，南京 210098，中國
摘要
廢活性污泥（WAS）中抗菌污染物的積累對厭氧發酵過程構成了挑戰，其對揮發性脂肪酸（VFAs）產生的機制性影響仍不甚明了。1,3,5-三嗪（triazine）是一種廣泛檢測到的三嗪類抗菌劑，它以濃度依賴的方式增強了VFAs的產生，最大產量達到了1771 mg COD/L（比對照組增加了18.4倍）。產量的增加伴隨著代謝方式的顯著轉變，從丙酸主導轉變為乙酸主導（從38.7%增加到54.3%），這一變化是由細胞外聚合物物質（EPS），尤其是蛋白質的系統性破壞所驅動的。分子對接研究表明，三嗪通過氫鍵和疏水相互作用誘導了蛋白質的構象不穩定性和結構損傷。同時，三嗪脅迫下銨氮濃度的增加進一步證實了蛋白質的水解，為VFAs的產生提供了易于發酵的底物（尤其是乙酸）。高通量16S rRNA測序揭示了微生物群落的濃度依賴性重組，其特征是蛋白水解細菌（Petrimonas）和乙酸生產者（Anaerovorax）的富集，同時甲烷生成菌受到抑制。使用PICRUSt2進行的功能宏基因組分析顯示，蛋白水解酶（例如EC:3.4.16.4）和乙酰輔酶A合成基因（例如PDHA）的表達上調，促進了蛋白質的水解和乙酸的生物合成。關鍵的是，三嗪脅迫激活了群體感應和雙組分調控系統，luxS的表達增加了5.7倍，促進了代謝協調和抗逆性，而不是群落的崩潰。偏最小二乘路徑建模證實，底物可用性（λ = 0.459）是VFAs積累的主要驅動因素，這一過程通過微生物群落的適應來實現（λ = 0.560）。這些發現揭示了抗菌脅迫如何通過EPS介導的代謝重編程來增強資源回收。
引言
污水處理廠（WWTPs）有效地去除了污染物，但不可避免地產生了大量的廢活性污泥（WAS）。WAS中含有大量的可生物降解有機物，使其成為厭氧消化生產揮發性脂肪酸（VFAs，特別是乙酸）的寶貴原料，這些脂肪酸在生物能源、環境修復和化學生產中有著廣泛的應用（Agnihotri等人，2022年；Owusu-Agyeman等人，2023年）。然而，復雜的成分和潛在的有害物質污染使得不當處理容易導致二次環境污染，從而增加了安全處理和資源回收的緊迫性（Liu等人，2024年）。藥物、消毒劑和合成抗菌劑的廣泛使用導致多種新興污染物（ECs）通過農業徑流、工業廢水和生活污水不斷進入WWTPs。其中，三嗪化合物這類含氮雜環化合物在農業化學品、樹脂材料和藥品中得到廣泛應用（Chakravarthi等人，2016年；Czarnota-?ydka等人，2023年；Deng等人，2021年），其在廢水中的濃度可達到0.24 mg/L（Suzuki等人，2021年；Zhu等人，2019年）。這些化合物具有優異的結構穩定性、廣譜抗菌活性和低生物降解性，使其在環境中具有高度持久性，降解率低于14%（An等人，2017年；Xu等人，2013年）。加上它們對顆粒物質的強親和力，這些特性使得它們優先分配到活性污泥中（分配率超過90%），而不是留在水相中。這種環境持久性令人擔憂，因為它們能夠破壞微生物膜并干擾關鍵代謝途徑，從而對微生物群落施加選擇壓力（Shah等人，2014年）。鑒于厭氧發酵生產VFAs嚴重依賴于微生物活性，因此闡明累積的三嗪類化合物對厭氧發酵的影響至關重要。
細胞外聚合物物質（EPS）在維持微生物系統的穩定性中起著關鍵作用。特別是EPS中的蛋白質成分具有高度反應性，是化學結合的主要靶標，在污染物暴露時構成第一道屏障，也是最脆弱的部分。作為結構和功能基質，EPS保護微生物細胞免受有毒化合物的傷害，并介導物質傳遞和底物結合（Wang等人，2024年）。越來越多的證據表明，外源污染物與EPS成分結合，導致結構破壞，進而影響微生物的功能。例如，磺胺嘧啶與EPS成分結合并誘導氧化應激，從而抑制污泥發酵過程中的水解和酸生成（Liang等人，2025年）。盡管人們對ECs與有機物之間的相互作用越來越關注，但專門研究復雜污泥厭氧系統中ECs-EPS功能的調查仍然有限。特別是三嗪的具體結合模式和破壞途徑及其對微生物功能的影響尚未探索，考慮到其在WAS中的高積累量和強抗菌活性，這是一個重要的知識空白（Fang等人，2023a；Zhang等人，2018年）。
與此同時，厭氧發酵本質上是微生物過程，包括四個連續的步驟：水解、酸生成、乙酸生成和甲烷生成（Pang等人，2023年）。ECs通過施加選擇性的抗菌壓力，抑制敏感菌群并促進耐藥菌群的富集，從而驅動群落層面的功能轉變，改變VFAs的產生譜型。重要的是，這些效應具有污染物特異性和菌群依賴性。抗生素抑制甲烷生成古菌，減少甲烷產量，同時增加VFAs的積累（Wu等人，2022年），而先前的研究發現，殺菌劑甲基異噻唑啉酮通過選擇性地重塑細菌群落結構來增強VFAs的產生（Fang等人，2023b）。此外，ECs的暴露會破壞對維持代謝活動和在壓力條件下保持群落穩定性至關重要的微生物適應過程。相反，適度的環境壓力會刺激底物代謝并激活維持微生物功能的調控途徑，表明厭氧菌群內部存在內在的自我調節機制。這些發現表明，ECs重塑了微生物代謝并擾亂了控制系統韌性的內在調控網絡。然而，對三嗪誘導的微生物群落重編程及其相關調控反應的機制理解仍然有限，需要對其生態和代謝后果進行系統研究。
本研究調查了三嗪對WAS厭氧發酵生產VFAs的影響，并揭示了其潛在機制。首先，探討了三嗪對VFAs產生效率的劑量依賴性效應。然后，分析了三嗪對EPS破壞和特定厭氧步驟動態變化的影響。隨后，利用16S rRNA基因測序來表征微生物群落在三嗪暴露下的變化。最后，通過PICRUSt2分析預測了代謝功能，以闡明在三嗪脅迫下的代謝調控、適應機制和生態影響。這些發現加深了對污染物-微生物相互作用的理解，并揭示了一種以蛋白質為中心的代謝重編程機制，該機制在三嗪脅迫下促進了VFAs的產生。
WAS和三嗪的特性
WAS來自中國南京的一個厭氧-缺氧-好氧（A2/O）污水處理廠。通過2.0毫米不銹鋼網過濾去除雜質后，污泥在4°C下自然沉淀24小時。WAS的主要特性如下：總懸浮固體（TSS）20.0 ± 0.2 g/L，揮發性懸浮固體（VSS）8.5 ± 0.1 g/L，pH 7.0 ± 0.1，總蛋白質6.0 ± 0.1 g/L，總碳水化合物1.3 ± 0.2 g/L。同時，三嗪（C3H3N3，97%，CAS編號：290–87-9）的含量為...
三嗪對WAS厭氧發酵過程中VFAs產生效率的影響
三嗪暴露以劑量依賴的方式顯著增強了VFAs的積累（圖1A）。在對照反應器（R1）中，VFAs的最大濃度僅為91.2 mg COD/L。然而，隨著三嗪劑量的增加（0.25–2 mg/g TSS），VFAs的濃度分別增加到180.1、222.2、872.3和1771.4 mg COD/L，相對于對照組分別增加了1.0、1.4、9.5和18.4倍。特別是，在R4和R5中VFAs的產生量高于...
結論
本研究表明，三嗪通過增強VFAs的積累和改變酸生成譜型（從丙酸向乙酸）來改變WAS的厭氧發酵。EPS的破壞釋放了豐富的蛋白質底物，使蛋白質成為主要的發酵原料。與此一致的是，蛋白水解細菌（如Petrimonas和Lutispora）得到富集，而甲烷生成菌受到抑制。蛋白水解代謝的增強加速了碳通量...
CRediT作者貢獻聲明
Jingyang Luo：寫作 – 審稿與編輯，監督，資金獲取，概念構思。Shumeng Yang：寫作 – 審稿與編輯，初稿撰寫，可視化，方法學，正式分析，數據管理。Qian Feng：寫作 – 審稿與編輯，方法學，研究。Xiang Zou：寫作 – 審稿與編輯，監督，方法學，概念構思。Yang Wu：寫作 – 審稿與編輯，可視化，數據管理。Feng Wang：寫作 – 審稿與編輯，監督，
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
本工作得到了“國家自然科學基金（編號：52470146）、“江蘇省自然科學基金（編號：BK20250189）、“中央高校基本科研業務費（編號：B250203008”以及“江蘇省高等教育機構優先學科發展計劃（PAPD）”的財政支持。
