《Bioresource Technology》：Direct interspecies electron transfer-based methanogenic aggregate: A survival strategy to overcome defensive attack from type VI secretion system during syntrophic cooperation
編輯推薦：
甲烷生成菌聚集體的直接電子轉移（DIET）機制通過電導性納米結構（如e-pili或c型細胞色素）實現長距離電子傳遞，形成松散多孔結構，抑制T6SS防御系統激活，從而提升高有機負荷條件下的穩定性。
李媛|潘佳宇|李陽|趙志強|張耀斌
工業生態與環境工程重點實驗室（大連理工大學），教育部，大連理工大學環境科學與技術學院，中國大連116024
摘要
由共生微生物形成的甲烷生成聚集體具有緊密的物理結構，這些微生物通過種間氫/甲酸鹽轉移（IHT/IFT）進行電子交換，這種結構會激活VI型分泌系統（T6SS）的防御性攻擊，而T6SS被認為是導致這些聚集體穩定性較差的主要原因。直接種間電子轉移（DIET）可能緩解由于接近性引發的T6SS防御性攻擊的技術瓶頸，因為共生微生物可以通過導電菌毛（e-pili）或其表達的c型細胞色素實現長距離電子轉移。本研究使用三個上流式厭氧污泥毯反應器，分別以乙醇、丙酸和丁酸作為唯一底物，培養了基于DIET和IHT/IFT的聚集體。基于DIET的聚集體通常體積更大，結構更為疏松多孔，而基于IHT/IFT的聚集體則相反。然而，流變行為顯示，基于DIET的聚集體具有更高的硬度和韌性，這歸因于導電菌毛網絡的結構支持。通過對單個基于DIET的聚集體進行納米工業計算機斷層掃描（CT）重建和成像，發現共生微生物并未表現出明顯的局部聚集模式。導電性-溫度/pH響應表明，基于DIET的聚集體表現出類似金屬的導電性，這與e-pili的特性相似。同時，表面增強拉曼光譜顯示，基于DIET的聚集體中與c型細胞色素相關的特征峰強度高于基于IHT/IFT的聚集體。宏基因組和宏蛋白質組數據分析表明，基于DIET的聚集體中T6SS關鍵蛋白的表達受到抑制。這些結果表明，在基于DIET的聚集體中，共生微生物沒有形成緊密的物理結構，從而避開了T6SS的防御性攻擊，增強了其穩定性。
引言
共生產酸菌與甲烷生成菌通過種間氫/甲酸鹽轉移（IHT/IFT）進行電子交換，這一過程被廣泛認為是厭氧消化過程中有機底物轉化為甲烷的核心“引擎”（Bryant等人，1967年）。IHT/IFT依賴于遵循菲克擴散定律的擴散過程，導致電子轉移效率與種間距離呈負相關（Stams，1994年）。因此，為了實現有效的IHT/IFT，共生微生物必須聚集形成緊密的物理結構以縮短種間距離（40–50 μm）（Felchner-Zwirello等人，2013年；Shen等人，2016年）。由此形成的基于IHT/IFT的甲烷生成聚集體（也稱為厭氧顆粒污泥）已成為高有機負荷率（OLR）厭氧反應器的典型特征（例如，上流式厭氧污泥毯[UASB]反應器（Chen等人，2020年）、擴展顆粒污泥床[EGSB]反應器（Li等人，2019年；Xie等人，2023年）和內循環[IC]反應器（Cao等人，2025年））。
盡管已經報道了幾種促進基于IHT/IFT的甲烷生成聚集體形成的策略（例如，金屬陽離子補充（Liang等人，2020年；Ma等人，2020年）、OLR優化（Batstone和Keller，2001年；Long等人，2015年）、回流調節（Wu等人，2009年）和進料改造（Zhou等人，2024年），但這些聚集體仍然存在穩定性差的問題（例如，抗水力剪切、應力緩沖和抗裂性），這限制了其在實際應用中的廣泛應用。主要原因在于緊密的物理結構會激活共生微生物的VI型分泌系統（T6SS）的防御性攻擊，T6SS是一種復雜的納米級管狀復合體，可作為分子武器系統（Rudzite等人，2023年）。收縮性納米管將毒性效應蛋白（如溶血素和肽聚糖水解酶）輸送到鄰近細胞中，導致細胞裂解（Ho等人，2014年）。雖然顆粒不穩定性由多種因素引起（如剪切應力和EPS組成），但這種由接近性引發的生物攻擊被認為是導致活性生物量損失和群落失衡的關鍵內部因素，進一步惡化了基于IHT/IFT的甲烷生成聚集體的穩定性（Smith等人，2023年）。
這引發了這樣一個關鍵問題：共生產酸菌與甲烷生成菌之間的電子交換是否可以通過獨立于IHT/IFT的機制進行。這意味著它們不再需要聚集形成緊密的物理結構來縮短種間距離，從而降低激活T6SS防御性攻擊的風險。一個顯著的例子是，在處理啤酒廠廢水的UASB反應器中，利用氫/甲酸鹽的甲烷生成菌僅占甲烷生成聚集體中的不到0.6%（Rotaru等人，2014年），表明IHT/IFT并非乙醇轉化為甲烷的主要方式。同時，這些甲烷生成聚集體表現出類似金屬的導電性（Morita等人，2011年），這與Geobacter sulfurreducens的導電菌毛（e-pili）在長距離（1–2 mm）細胞外電子轉移中的作用相似（Liu等人，2020年；Fe(III)（Tan等人，2017年）和細胞（Shrestha等人，2014年；Summers等人，2010年）。基于這些考慮，我們假設在處理啤酒廠廢水的UASB反應器的甲烷生成聚集體中，共生產酸菌與甲烷生成菌主要通過直接種間電子轉移（DIET）進行電子交換。有趣的是，我們之前的研究（Zhao等人，2016年）發現，最初以乙醇為底物的UASB反應器中甲烷生成聚集體的導電性比不使用乙醇時高5–76倍，且其對OLR影響的抵抗力也比不使用乙醇時高2–8倍。此外，一項針對處理甘蔗渣廢水（主要為乙醇型發酵中間產物）的工程規模UASB反應器的案例研究（Zhao和Zhang，2019年）發現，甲烷生成聚集體的導電性是實驗室規模UASB反應器的2–4倍，其對OLR影響的抵抗力也是后者 的1.5–3.2倍。
顯然，在以乙醇或乙醇型發酵中間產物為底物的UASB反應器中，DIET是共生代謝的主要方式（Zhao等人，2016年；Zhao和Zhang，2019年）。在這種情況下，共生產酸菌與甲烷生成菌通過e-pili（Ueki等人，2018年）或其表達的c型細胞色素（Liu等人，2018年）實現長距離電子轉移。這可能突破了基于IHT/IFT的甲烷生成聚集體中常見的由接近性引發的T6SS防御性攻擊的技術瓶頸，并顯著增強了高OLR條件下的甲烷生成聚集體的穩定性。這可能是以乙醇（Zhao等人，2016年）或乙醇型發酵中間產物（Zhao和Zhang，2019年）為底物的UASB反應器能夠抵抗更高OLR影響的主要原因，這值得進一步研究。
基于這些考慮，分別使用乙醇、丙酸和丁酸作為唯一底物進行了三個UASB反應器的實驗。選擇丙酸和丁酸作為唯一底物，是因為在UASB反應器的甲烷生成聚集體中，IHT/IFT是丙酸/丁酸轉化為甲烷的主要方式（Zhao等人，2016年）。通過對比基于DIET和IHT/IFT的甲烷生成聚集體在形態、粒徑、比表面積和流變行為方面的差異，探討了兩者之間的特性差異。在此基礎上，評估了導電性、電化學活性和微生物群落，以明確在基于DIET的甲烷生成聚集體中，共生產酸菌與甲烷生成菌是通過e-pili或c型細胞色素實現長距離電子轉移的。通過納米工業計算機斷層掃描（CT）成像觀察了單個甲烷生成聚集體中微生物簇的空間分布，并進一步分析了T6SS的基因豐度和蛋白質表達。通過比較基于DIET和IHT/IFT的聚集體在空間分布、導電特性和T6SS表達方面的差異，本研究旨在闡明共生微生物如何逃避T6SS防御性攻擊的潛在機制。這些發現有望為共生微生物的生存策略和高OLR厭氧反應器中甲烷生成聚集體穩定性的增強提供新的見解。
反應器配置和操作
每個UASB反應器的有效工作體積為1500 mL，內徑為70 mm，高度為300 mm。每個反應器頂部連接有一個氣體采樣袋，該采樣袋連接到三相分離器。啟動前，每個UASB反應器接種了450 mL的種子污泥。這些種子污泥的總固體（TS）濃度為13900 ± 130 mg/L，揮發性固體（VS）濃度為9280 ± 73 mg/L，來源于中國大連的一個處理活性污泥的厭氧消化器。
甲烷生成聚集體的一般特性
甲烷生成聚體的粒徑分布如圖1D和E所示。以乙醇為底物的UASB反應器中甲烷生成聚體的中位粒徑為163 μm，分別是以丙酸（111 μm）和丁酸（98 μm）為底物的UASB反應器的1.47倍和1.66倍（圖1D）。相應地，以乙醇為底物的UASB反應體的Dv(10)、Dv(50)和Dv(90)值也高于以丙酸和丁酸為底物的UASB反應體。
結論
已認識到，由接近性引發的T6SS防御性攻擊是導致基于IHT/IFT的甲烷生成聚集體穩定性較差的主要原因。本研究發現，在基于DIET的甲烷生成聚集體中，電活性細菌（如Desulfovibrio、Clostridium和Geobacter）和甲烷生成菌（如Methanobacterium）并未聚集形成IHT/IFT基聚集體中常見的緊密物理結構。
未引用的參考文獻
Huerta-Cepas等人，2017年；Lovley，2017年。
CRediT作者貢獻聲明
李媛：撰寫——初稿、可視化、驗證、軟件、方法學、數據管理、概念化。潘佳宇：軟件。李陽：撰寫——審稿與編輯、監督。趙志強：撰寫——審稿與編輯、監督、方法學、正式分析。張耀斌：監督、正式分析。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
