內在無序蛋白（IDPs）及其內在無序區域（IDRs）曾一度被認為是無結構、無功能的“蛋白質暗物質”，但如今已被認識到是許多生物學過程的關鍵調控者。它們約占其核生物蛋白質組的30%，在癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病等眾多疾病相關通路中扮演核心角色。盡管其普遍存在且具有重要的生物醫學意義，但令人驚訝的是，目前針對IDPs/IDRs開發、特別是已上市的小分子藥物卻寥寥無幾。這種持續存在的差距并非源于缺乏興趣，而是反映了生物物理、技術和數據驅動等多重障礙的復雜交織。

這篇綜述深入探討了阻礙小分子藥物靶向IDPs的三個相互交織的根本原因：其一，它們的結合機制從根本上不同于結構化蛋白；其二，它們帶來了顯著的實驗和計算挑戰；其三，該領域缺乏應用現代人工智能驅動的藥物發現工具所需的數據。

靶向IDPs的理由十分明確：它們在轉錄調控、信號轉導和應激反應中發揮著核心作用，這些功能通常需要快速的構象動力學和多方面的相互作用。它們的失調與多種病理過程有關，例如，α-突觸核蛋白和Tau蛋白分別是帕金森病和阿爾茨海默病中的關鍵IDPs，而c-Myc、p53和NUPR1則是癌癥中與眾多伙伴相互作用的IDPs。

除了普遍性，IDPs還提供了大量尚未開發的治療機會。傳統藥物靶點受限于結構化的活性位點，而IDPs則提供了調控更廣泛相互作用網絡、支架組裝和相分離區室的潛力。重要的是，靶向無序區域的新興策略可能為克服因結構化域（例如神經母細胞瘤中的Aurora A激酶結構域、肺癌中的ALK、白血病中的BCR-ABL）突變而產生的耐藥性提供替代途徑。在這些系統中，耐藥性通常由破壞明確結合口袋的點突變引起。相比之下，通過動態或基于集合的相互作用與無序區域結合的配體并不依賴于單一剛性口袋，因此可能對孤立的破壞口袋的突變不那么敏感。這并不意味著IDRs本質上能抵抗突變，而是意味著耐藥機制預期會有所不同，因為結合和功能分布在多個瞬態接觸中，而非單一特定位點。

然而，藥物發現進展緩慢。與酶或G蛋白偶聯受體（GPCRs）不同，IDPs缺乏深的、明確的口袋或溝槽來容納傳統配體。盡管如此，IDPs并非必然不能被小分子靶向；它們的相互作用機制只是與涉及結構化蛋白的結合不同。

傳統藥物發現主要集中于結構化的蛋白質靶點，這些靶點通常是具有明確構象狀態和預先形成、可及結合口袋的球狀蛋白。在此框架下，結合親和力通過最大化有利的焓相互作用（例如氫鍵、范德華力、靜電作用）并最小化與限制分子運動相關的熵罰來優化。該策略對剛性靶點非常有效，其配體結合僅需適度的結構重組。優化有利的熵貢獻很少成為設計重點，即使考慮，也通常僅限于從疏水口袋中置換有序水分子。

相比之下，IDPs缺乏穩定的三級結構，而是以快速相互轉換的構象動態集合形式存在。這種靈活性反映了高構象熵，即在未結合狀態下有許多可及的微觀狀態。這種高構象熵穩定了無序集合相對于更有序的構象。

配體（無論小分子、蛋白質還是核酸）與IDP的結合，通常意味著限制蛋白質的構象自由度，從而施加熵罰（ΔS < 0），除非被強的焓貢獻抵消，否則會顯著降低結合親和力。雖然這種熵損失對于結構化蛋白通常很小，但對于IDPs來說可能相當可觀，甚至可能阻礙結合。

因此，IDP-配體相互作用的熱力學可能偏離經典預期。盡管總體結合自由能（ΔG）仍必須為負才能使結合發生，但焓（ΔH）和熵（ΔS）的貢獻可能與在涉及折疊蛋白的配體相互作用中觀察到的有顯著差異。小分子與單體IDP之間的非共價相互作用可能表現出適度的焓增益，而嚴重依賴于熵貢獻，例如溶劑重組或結合態主鏈動力學的增加。

基本的熱力學關系 ΔG = ΔH - T ΔS 可以展開以反映水環境中蛋白質-配體相互作用的具體組分：

ΔG = ΔH_prot&mol+ ΔH_system? T(ΔS_prot+ ΔS_mol+ ΔS_system)

其中，ΔH_prot&mol捕獲蛋白質和配體之間的直接焓相互作用，而 ΔH_system計入溶液環境（例如緩沖液、水、離子）的貢獻。熵項包括蛋白質（ΔS_prot）和配體（ΔS_mol）的構象熵、旋轉熵和平動熵，以及系統熵（ΔS_system），它反映了結合時緩沖液/水/離子環境的變化。ΔS_system常因水重組和疏水表面水分子的置換而變得有利，對于高電荷IDPs，還可能包括抗衡離子釋放帶來的有利貢獻。

大多數常規藥物被優化以增強結合焓（ΔH_prot&mol），其假設是熵罰適中，可以基本忽略、最小化或通過溶劑效應補償。然而，對于IDPs，構象熵分量（ΔS_prot）是一個主要且常常是限制性因素。未結合蛋白質的內在無序性意味著，任何施加實質性結構約束的結合事件都可能帶來巨大的熵成本。值得注意的是，結合誘導折疊可能會招致非常大的構象熵損失，但這仍可能被有利的溶劑貢獻（例如去溶劑化）所抵消，從而產生適度的凈熵變。幾種廣泛的策略已出現以應對這一熱力學障礙：

一種策略是設計能夠形成足夠強焓相互作用以抵消熵罰的配體。這一原理的最新證明來自于從頭設計蛋白質結合劑，其通過從無序集合中選擇和穩定特定構象來與IDPs結合。這些相互作用依靠主鏈氫鍵和形狀互補性來抵消約束高度動態靶標的熵成本。盡管這些結合劑提供了令人信服的概念驗證，但其治療轉化面臨實際挑戰，包括細胞內遞送和潛在的免疫原性。小分子是否能實現類似策略仍不確定，因為此類配體通常提供較低的相互作用表面積，因此可能提供更少的氫鍵、靜電接觸和其他穩定相互作用的機會。

第二種方法是接受構象熵，最小化罰分甚至利用靶標IDP的殘余無序性。從統計力學角度看，在結合態保持動態靈活性，形成所謂的“模糊復合物”，可以在不依賴剛性的、以口袋為中心的、焓主導的識別情況下產生凈有利的ΔG。這種熵驅動識別在蛋白質-蛋白質組裝中有詳細記載，并且現在也出現在小分子/IDP系統中。在這種觀點下，結合是一個熱力學事件。只有當配體的占有率超過預期（來自本體溶劑）時，才被視為“結合”；否則，它只是被共溶劑化。對于接觸可能高度動態和瞬態的IDPs，這種區分至關重要。對BindingDB中等溫滴定量熱數據的分析表明，IDPs和IDRs（近似為具有低平均預測局部距離差異測試得分的蛋白質）可以同時具有有利的焓（ΔG）和熵（-TΔS）貢獻，盡管這些相互作用可能涉及配體與結構化結構域的結合。

雖然上述兩種策略都依賴于可逆結合，但第三種正交方法涉及共價修飾，其中配體與IDP形成不可逆或緩慢可逆的鍵。這種方法繞過了對高親和力非共價相互作用的需求，使其對具有高構象熵和淺的、瞬態結合位點的靶點特別有吸引力。最初的識別事件仍遵循經典熱力學原理，但隨后的共價步驟會捕獲即使是微弱或短暫的復合物，將配體固定。例如，靶向雄激素受體N端結構域的EPI系列共價IDP結合劑，就體現了這種方法，它通過將配體錨定在無序區域內，而不一定需要穩定的折疊口袋。

替代治療模式同樣降低了對傳統高親和力結合口袋的需求。例如，蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）通常通過中等結合親和力（高納摩爾到微摩爾K_d）發揮作用，以招募E3泛素連接酶到靶蛋白，其不依賴于持續的靶點占有率，因為藥理活性是由生產性三元復合物的形成和催化周轉驅動的，而非持續結合。分子膠同樣通過協同結合來穩定或誘導蛋白質-蛋白質相互作用，通常涉及弱或瞬態的接觸，而非長期占據明確的位點。因此，這兩種方法都可以有效地參與IDPs特有的淺結合位點和瞬態構象狀態。

這種將IDP配體視為動態集合調節劑而非單一結合結構穩定劑的轉變，對IDP配體設計具有重要影響。經典策略，如剛性化配體以減少ΔS_prot，在IDP背景下可能適得其反，因為在IDPs中，靈活性、無序性和多價性常與功能相關。相反，有效的配體可能需要耐受甚至促進無序，識別瞬態狀態，或在不確定義折疊結構的情況下轉移構象平衡。

除了單個結合事件，IDPs還經常與其他生物分子形成高階組裝，這引入了額外的復雜性。IDPs可以形成多價相互作用，發生寡聚化，或驅動液液相分離。IDPs是此類組裝的核心，這些組裝是動態的、協同的和依賴于環境的。與經典的二元相互作用不同，這些組裝表現出涌現特性，包括對IDPs自身濃度的敏感性和弱的多價結合，這違背了標準的藥物發現模型。

一個值得注意的案例是EPI-001及其相關分子，它們是首個進入臨床試驗的靶向IDR的藥物樣小分子。EPI-001是一種共價結合劑，靶向雄激素受體的N端反式激活域。這些分子不誘導折疊，而是穩定該結構域在其無序狀態下的寡聚形式，偏離了經典的1:1結合模型。寡聚化也在無序的細胞周期調控因子p27^Kip1中有報道，其中小分子被證明可將該蛋白質隔離成可溶性寡聚體，從而改變其構象景觀并抑制其功能，而無需誘導折疊。

盡管復雜，此類組裝與疾病相關，特別是在神經退行性疾病和癌癥中，使其成為高價值但困難的靶點。在這些情況下，必須從整個系統層面考慮結合自由能，包括高階相互作用和涌現行為。最近的研究表明，小分子在生物分子凝聚物中的富集可能主要源于一般的物理化學性質，如疏水性和溶解性，而非立體特異性結合，進一步強調了無序系統中涌現的生物物理環境的重要性。

綜上所述，這些特征強調了經典的“緊口袋/緊配體”范式在IDP領域被打破的程度。在這里，治療靶點不是單一的構象，而是一個快速交換的微觀狀態集合，而且常常是高階寡聚體或相分離凝聚物。因此，藥物化學、計算模型和檢測設計必須從最大化單一結合ΔH轉變為重塑整個自由能景觀，例如，通過穩定良性的單體亞集合、穩定非活性的寡聚體，或防止病理性的相分離或各種形式的聚集。藥物發現的視角也應改變，從尋求單一的靜態結合模式，轉向接受這樣的觀點：藥效可能來自調節動態、亞穩態組裝的分布和動力學，而非僅僅來自剛性的分子識別。

第二個主要障礙在于我們當前生物物理工具包的技術限制，這些工具主要是為結構化蛋白開發的。傳統的結構生物學方法，如X射線晶體學，從根本上與IDPs不兼容，因為IDPs缺乏晶體形成所需的穩定構象。冷凍電子顯微鏡雖然對大蛋白質復合物具有變革性，但在捕獲IDPs特有的構象異質性和快速動力學方面仍有限制。盡管在將冷凍電鏡應用于動態系統方面正在取得進展，但由于其極高的靈活性，冷凍電鏡在高度無序的IDP-配體復合物中的應用在很大程度上仍然棘手。最近，冷凍電子斷層掃描已開始提供對生物分子凝聚物結構和形態的見解，但其在分子水平上對IDPs的應用仍處于起步階段。

相比之下，溶液態核磁共振光譜是研究IDPs的獨特理想工具。IDPs的典型大小范圍落在NMR的靈敏度窗口內，其靈活性產生了尖銳且分辨良好的信號。此外，該技術提供了原子水平上關于蛋白質在廣泛時間尺度上動力學的信息。因此，NMR常被認為是表征IDPs及其相互作用的金標準。然而，一個關鍵限制是，許多標準蛋白質檢測NMR實驗對結合事件敏感性最低，特別是當相互作用微弱或瞬態，導致化學位移變化很小或沒有時。這可能導致假陰性，即使結合確實發生。相反，配體檢測NMR實驗已被證明可以檢測到此類相互作用，因為它們對配體翻滾和交換變化的敏感性更高，這使得它們在IDP-配體研究中特別有價值，因為結合可能不會顯著擾動蛋白質譜。

盡管具有潛在效用，NMR光譜學的入門門檻很高。實驗通常需要相對高濃度（通常是數十到數百微摩爾）的同位素標記樣品。生產此類樣品在技術上既具挑戰性又昂貴，特別是對于易于聚集或易受蛋白水解的IDPs。此外，重組表達系統通常缺乏天然的翻譯后修飾，可能限制結果的生物學相關性。而且，NMR數據不直接產生結構。相反，每個原子核通常為光譜貢獻一個或多個峰，共振歸屬的過程是勞動密集且耗時的，通常需要數月的工作來完成一個中等大小IDP的分析。這在規模化地將NMR應用于無序系統時造成了實質性瓶頸。這在生物磁共振數據銀行中沉積的、已通過NMR表征的人類蛋白質組IDPs數量極少這一點上得到證明。這一限制與藥物發現直接相關，因為NMR是為數不多的能夠提供IDP-配體相互作用的殘基水平、溶液態信息的方法之一，支持苗頭化合物驗證、作用機制研究和苗頭化合物到先導化合物的優化。

其他生物物理技術，如氫-氘交換質譜、小角X射線散射、單分子熒光相關光譜和單分子熒光共振能量轉移，為探測蛋白質動力學提供了有價值的補充工具。這些方法在不需要高結構分辨率的情況下表征構象集合和結合機制時特別有用。然而，這些技術各自在特定的時間尺度上操作，僅捕獲動態行為的某些方面，這可能限制其完全表征瞬態或異質性相互作用的能力。與NMR一樣，這些技術需要專門的儀器和專業知識，強調了更廣泛的需求，即需要更易獲取、可擴展且針對IDP優化的生物物理方法。

計算技術，特別是分子動力學模擬，是探索IDP構象景觀及其與小分子相互作用的強大手段。力場、增強采樣算法、實驗數據集成和硬件加速的改進極大地擴展了這些模擬的能力，無論是在準確性還是在可及的時間尺度上。在結構化蛋白質系統中，自由能擾動等模擬協議在昂貴的化學合成之前用于預測配體親和力已成為常規。然而，IDPs仍然是一個挑戰：它們的動態特性需要長時間模擬，而且力場對無序區域的調整仍不完美，導致偏差和偽影。最近的進展使得能夠快速生成原子級的IDP集合，有幾種方法使用AlphaFold衍生的距離分布來指導構象采樣，或訓練深度生成模型來模擬構象景觀和熱力學。然而，大多數IDP-配體相互作用的計算研究仍然是針對特定系統的，通常將廣泛的分子動力學模擬與仔細的集合構建和分析相結合。雖然這些方法產生了有價值的機制見解，并且在特定情況下與實驗有令人鼓舞的一致性，但目前還沒有一個廣泛使用的、標準化的、高通量的工作流程，扮演對接在折疊蛋白中所扮演的角色。需要解析龐大、異質的構象集合，再加上采樣成本、無序狀態力場的不準確，以及弱動態結合基準數據集的有限，這些共同限制了規模化應用的可靠性。

生物環境增加了進一步的復雜性。與折疊蛋白相比，IDP集合通常對pH、離子強度、分子擁擠、濃度和翻譯后修飾更敏感。這些環境變量可以極大地重塑構象集合，調節結合相互作用，或觸發相分離。因此，應在生理相關條件下并使用適當的亞型和翻譯后修飾來研究IDPs，以確保結論對治療開發有意義。

同時，藥物發現的高通量需求對無序靶點提出了尚未解決的挑戰。即使對于結構化蛋白，高通量篩選對于探索巨大的化學空間和識別可行的先導化合物也是不可或缺的。然而，大多數高通量篩選平臺是圍繞剛性口袋設計的，并調整為檢測高親和力、焓主導的相互作用。這些方法可能不適用于IDPs，IDPs通常以低到中微摩爾親和力、短停留時間、多聚化和強熵分量參與結合，所有這些都可能將苗頭化合物推到經典檢測方法的檢測閾值以下。