《Dental Materials》：Bioengineered polycaprolactone nanofibers co-loaded with RGD and asiatic acid for dentin–pulp regeneration
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研究利用電紡聚ε-己內酯（PCL）納米纖維復合RGD肽和Asiatic酸，通過SEM、FTIR等表征其形貌與化學結構，證實其高機械強度和熱穩定性。體外實驗顯示該納米纖維對 Enterococcus faecalis 抑制率達77.11%，且促進牙本質干細胞遷移及 odontogenic/angiogenic 標記基因表達，礦化恢復效率達76.21%，硬度提升3.9倍，證實其作為生物活性支架的潛力。
Karthikeyan Kandaswamy|Ajay Guru|Shalini Kapoor|Siva Prasad Panda|Uttam Prasad Panigrahy|Vikhashini PM|Hariharan Annadurai|Raghunandhakumar Subramanian|Santhosh Pugazh|Rupesh Gupta|Ankita Mathur|Gokul Sudhakaran|Senthil Rethinam|Mohd Hafiz Jamaludin|Sabry M. Attia|Ahmed Nadeem
納米生物產品研究實驗室（NBRL），藥理學系，Saveetha牙科學院及醫院，Saveetha醫學與技術科學研究所（SIMATS），Saveetha大學，泰米爾納德邦金奈600 077，印度
摘要
目的
再生牙髓-牙本質復合體仍是修復牙科領域面臨的主要挑戰。仿生納米纖維膜作為一種可吸收的支架，能夠促進細胞滲透、血管形成以及牙本質-牙髓復合體內的牙本質橋構建，因此提供了一種有前景的治療策略。在本研究中，通過靜電紡絲技術合成了含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽和亞洲酸（AA）的聚己內酯（PCL）納米纖維。
方法
通過靜電紡絲成功合成了這些納米纖維，并將RGD和AA整合到PCL基質中。利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察其形態結構，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）評估化學相互作用，以及接觸角分析來測定表面潤濕性。同時還評估了其機械強度、熱穩定性以及對Enterococcus faecalis的抗菌活性。通過MTT試驗、細胞遷移試驗以及qPCR檢測牙髓干細胞（DPSCs）的牙源性及血管生成相關標記物的表達來評估生物相容性。此外，還利用微計算機斷層掃描（micro-computed tomography）和維氏硬度測試（Vickers microhardness testing）方法研究了牙本質的再礦化過程。
結果
共負載RGD和AA的納米纖維表現出優異的性能，其拉伸強度為7.18 MPa，并具有出色的熱穩定性。抗菌分析顯示，這種納米纖維對E. faecalis的抑制率為77.11%，且對DPSCs的活力沒有負面影響。RGD和AA納米纖維使牙本質的礦物密度恢復了76.21%，處理后的牙本質樣本硬度比對照組提高了3.9倍。基因表達分析表明，在RGD和AA納米纖維培養的細胞中，牙源性標記物（DSPP、DMP1）和血管生成標記物（VEGF）的表達顯著上調，證實了其在促進細胞分化方面的生物活性。
意義
所開發的RGD和AA共負載的PCL納米纖維膜具有優異的生物相容性、抗菌效果以及促進牙源性反應的基因表達上調能力，顯示出作為牙髓-牙本質復合體再生生物活性支架的潛力。
引言
牙本質-牙髓復合體在調節牙齒活力方面起著關鍵作用。該復合體維持體內平衡，并在受到創傷或感染刺激時啟動修復和再生過程[1]。牙本質是一種分層組織的生物礦化組織，由富含膠原蛋白的有機基質構成，其中嵌入了羥基磷灰石晶體，這些晶體由高度特化的細胞——成牙本質細胞分泌[2]、[3]。三級牙本質形成是一種修復過程，可由齲齒、創傷或修復干預等外部刺激激活[4]。根據損傷程度不同，三級牙本質可分為反應性牙本質（由存活的成牙本質細胞合成）和修復性牙本質（由牙髓前體細胞分化形成）。這一過程涉及牙本質基質釋放生物活性分子，隨后招募和遷移牙髓前體細胞，并激活調控細胞外基質沉積和礦化的分子通路[5]、[6]。調節這些細胞和分子機制對于推進旨在促進牙本質形成和控制牙髓-牙本質復合體功能完整的再生牙髓學策略至關重要。
生物礦化是一個高度調控的生物過程，其中無機礦物質沉積形成結構復雜的硬組織[7]。包括牙釉質和牙本質在內的硬組織具有出色的機械強度，負責保護牙齒和咀嚼功能[8]。生物礦化的調控受到多種因素影響，如pH值波動[9]、鈣磷平衡紊亂[10]以及微生物感染[11]。這些因素可能導致脫礦，損害牙齒組織的結構完整性和功能。當口腔內的pH值低于約5.5的臨界閾值時（通常由產酸性生物膜活動、頻繁攝入可發酵碳水化合物以及唾液緩沖能力下降引起），牙齒硬組織會發生脫礦[12]、[13]。口腔疾病是全球最常見的非傳染性疾病之一，其中牙齒硬組織的脫礦是主要原因之一，這會導致結構損傷、微生物侵入和牙髓病變[14]。產酸性細菌生物膜在牙齒表面的活動是導致脫礦的主要原因之一[15]，它們釋放的有機酸會降低微環境的pH值，低于羥基磷灰石的溶解閾值，從而引發白色斑點病變并加速礦物質流失，最終損害牙本質的完整性[16]、[17]、[18]。目前的治療方法是將脫礦的羥基磷灰石從牙齒中清除，然后用合成材料填充齲洞[19]。這種修復體與牙齒之間的物理化學不匹配會導致微滲漏，進而引發二次齲齒[20]。因此，迫切需要開發既能改善現有治療效果，又能實現受損牙齒結構原位整合和再礦化的生物活性替代策略。
肽類短鏈氨基酸因其生物學特性和靶向治療的潛力，在現代牙科中成為有前景的生物活性物質[21]。在牙科領域，肽類通過防止脫礦、促進再礦化、促進牙釉質晶體成熟以及刺激硬組織再生等多種方式發揮作用[22]。抗菌肽（AMPs）也被研究用于治療多種口腔疾病，包括齲齒、牙周病、種植體周圍炎和口腔癌[23]。Arg-Gly-Asp（RGD）是一種源自細胞外基質蛋白（如纖維連接蛋白）的公認細胞結合基序，廣泛用于促進整合素介導的細胞粘附[24]。將RGD序列整合到生物材料中可顯著提高多種細胞的附著能力，從而增強其生物活性[25]。研究表明，RGD肽的整合能夠誘導人類牙髓干細胞的成骨分化[26]。RGDS肽（RGD的類似物，延長了一個絲氨酸殘基）與生物活性玻璃結合，可促進牙本質內的礦化[27]。因此，本研究利用RGD肽來發揮其促進牙本質再礦化和刺激牙髓細胞再生的作用。
在感染情況下，牙齒硬組織可能會受到嚴重損害，導致齲齒、牙髓壞死和牙周病[28]。Enterococcus faecalis（E.faecalis）被認為是持續性根管感染的關鍵病原體，其在根管壁上的強健生物膜形成是導致根管治療失敗的原因之一[29]、[30]。E. faecalis對抗生素的耐藥性使其能夠在治療后的根管內持續存在并重新定植，同時也限制了傳統抗菌劑的短期療效[31]、[32]。這些局限性凸顯了開發新型持久性治療劑的必要性，以破壞根管內的生物膜并減輕酸介導的脫礦作用。亞洲酸（AA）是一種具有生物活性的五環三萜苷元，廣泛存在于藥用和可食用植物中，Centella asiatica是其重要來源[33]、[34]。AA對Pseudomonas aeruginosa、Candida albicans和Staphylococcus aureus等病原體具有強效抗菌作用，顯示出其作為治療劑的潛力[35]、[36]、[37]。此外，它還具有強抗氧化和抗炎特性，進一步增強了其在再生治療中的應用價值[38]。
納米牙科技術正在快速發展，利用工程納米材料、納米級遞送平臺以及納米機器人的潛力來預防、診斷和治療多種口腔疾病[40]。在根管治療中，基于納米材料的平臺已成為關鍵工具，其定制的物理化學性質賦予了強大的抗菌活性、長效藥物釋放能力和出色的再生潛力[41]。靜電紡絲納米纖維因其高表面積與體積比和互連的孔隙結構而成為當前牙科材料研究的熱點[42]。這些膜不僅可以封裝大量治療劑和生長因子以實現可控遞送，還被用于再生牙組織，包括牙髓-牙本質復合體、牙周韌帶和牙槽骨[43]、[44]、[45]、[46]。聚（ε-己內酯）（PCL）納米纖維無毒、生物相容且可生物降解，同時具有優異的機械強度，這些特性使其在多種牙科應用中得到廣泛應用[47]。PCL納米纖維在牙髓-牙本質復合體治療中的應用包括生物活性和肽修飾系統，顯著促進了牙本質的再礦化和牙髓組織的再生[48]。
本研究提出了一種新的策略，通過開發共負載AA和RGD肽的靜電紡絲PCL納米纖維來促進牙本質再礦化和牙髓組織再生。這些生物活性納米纖維旨在針對E. faecalis生物膜，抑制脫礦，并增強牙髓干細胞的細胞反應。主要目的是研究RGD和AA在PCL基質中的共載對牙本質礦物恢復和牙髓細胞再生能力的綜合影響。這些納米纖維經過詳細物理化學表征，包括表面形態、機械性能和熱行為分析。其生物活性通過體外實驗評估了生物相容性、細胞遷移以及DPSCs中牙源性及血管生成相關標記物的基因表達。同時，還通過維氏硬度測試和微計算機斷層掃描進行了體外牙本質再礦化分析。我們假設RGD肽和AA在PCL納米纖維基質中的共載能夠協同增強抗菌活性，支持DPSCs的牙源性分化，并提高牙本質再礦化效率。
部分摘錄
倫理聲明
人類牙髓干細胞（hDPSCs）來自印度金奈Saveetha牙科學院及醫院提供的20-25歲健康捐贈者的新鮮提取的無齲第三磨牙。研究方案已獲得機構倫理委員會（IHEC/SDC/FACULTY/25/PHARM/148）的審查和批準，在樣本收集前所有參與者均簽署了書面知情同意書，符合赫爾辛基宣言的要求。
AA對E. faecalis的抗菌和抗成熟生物膜活性
最初，使用肉湯稀釋法評估了AA對E. faecalis的抗菌效果。結果顯示，AA在10 μg/mL濃度下對E. faecalis表現出強效抑制作用，抑制率為91.78%，該濃度被確定為最小抑菌濃度（MIC）。陽性對照（0.2%氯己定）的抗菌活性為95.13%，如補充圖1A所示。在更高濃度（10和20 μg/mL）下，也觀察到了有效的細菌生長抑制效果。
討論
生物礦化過程對維持牙本質-牙髓復合體的結構和功能完整性至關重要[56]、[57]。然而，產酸性微生物生物膜和牙齒表面的pH值波動會顯著干擾這一過程。這些生物膜會逐漸導致牙釉質脫礦，最初引起其破裂并暴露出下面的牙本質[58]。由此產生的酸性環境會抑制再礦化并加速結構惡化。
結論
總之，本研究表明，共負載亞洲酸和RGD肽的靜電紡絲PCL納米纖維在促進牙本質再礦化和牙髓組織再生方面表現出良好性能。所開發的納米纖維具有改進的機械強度、熱穩定性和抗菌效果，并能支持礦物沉積。體外實驗結果表明其具有良好的細胞相容性，并增強了牙髓的牙源性和血管生成反應。
倫理批準
本研究使用的人類牙齒提取獲得了印度金奈Saveetha牙科學院的科學審查委員會批準（批準編號：571/05/2025/PHD/SRB/SMCH）。所有體外實驗均符合機構倫理指南和標準。
資助
本研究得到了沙特阿拉伯利雅得King Saud大學的正在進行的研究資助計劃（ORF-2026-124）的支持。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文研究結果的財務利益或個人關系。
致謝
作者感謝沙特阿拉伯利雅得King Saud大學的正在進行的研究資助計劃（ORF-2026–124）的支持。本研究還在馬來西亞Kelantan大學的博士后資助計劃下完成。
