新冠病毒（SARS-CoV-2）的肆虐促使全球科學家加速尋找新的治療策略。在病毒復制周期中，主蛋白酶（Main Protease, M^pro）扮演著至關重要的角色，它負責切割病毒多聚蛋白，是病毒成熟和復制的關鍵。因此，M^pro成為一個極具吸引力的藥物靶點。傳統的藥物開發策略主要聚焦于設計小分子抑制劑，通過占據酶的活性位點來阻斷其功能。然而，這種“占據驅動”的策略有時會面臨選擇性、耐藥性以及難以靶向某些“不可成藥”蛋白的挑戰。

近年來，一種名為“蛋白水解靶向嵌合體”的新技術正在改變藥物發現的格局。PROTAC是一種異雙功能分子，它像一座分子橋梁，一端結合目標蛋白，另一端招募細胞內的“垃圾處理系統”——E3泛素連接酶。當PROTAC將目標蛋白和E3連接酶拉到一起時，會啟動一個稱為泛素化的過程，給目標蛋白貼上“銷毀”標簽，隨后被蛋白酶體降解。與傳統的抑制劑不同，PROTAC的作用是催化性的，一個PROTAC分子可以循環使用，降解多個目標蛋白，因此可能具有效力更強、作用更持久、并能克服耐藥性的潛力。這項技術已在癌癥治療領域取得了顯著進展，多個PROTAC藥物已進入臨床試驗。那么，能否將這把“分子手術刀”應用于對抗病毒感染呢？這正是本研究試圖探索的前沿問題。

此前，研究人員通過計算機虛擬篩選平臺，從大量化合物中識別出了一個新的SARS-CoV-2 M^pro抑制劑，代號為化合物19。這個化合物具有一個獨特的化學骨架：四氫苯并噻吩-2-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。它不僅能在體外抑制M^pro的活性，還能在細胞模型中有效抑制SARS-CoV-2以及另一種常見的人冠狀病毒HCoV-OC43的復制，顯示出一定的廣譜抗冠狀病毒潛力。基于這個有前景的“彈頭”，研究團隊決定將其升級改造，利用PROTAC技術，開發能夠直接降解病毒M^pro蛋白的新型抗病毒武器。

研究人員運用了多項關鍵技術方法來推進這項研究。在化合物設計階段，他們借助計算機模擬軟件（FLAP）預測了先導化合物19與M^pro的結合模式，從而確定了用于連接 linker 的最佳位點。在化學合成方面，他們通過多步有機合成反應，包括Gewald反應、酰胺縮合（使用HATU等縮合劑）和 Boc 保護/脫保護策略，成功構建了目標PROTAC分子庫。在生物學功能驗證中，他們采用了標準的抗病毒實驗（蝕斑減少試驗、病毒產量減少試驗）和細胞毒性試驗（MTT法）來評估化合物的活性和安全性。為了確認PROTAC的作用機制，他們使用了蛋白質免疫印跡法來檢測M^pro蛋白水平的降解，并利用微尺度熱泳動技術來測定化合物與M^pro蛋白的直接結合力。此外，他們還通過加入E3連接酶抑制劑（VH298）和蛋白酶體抑制劑（MG132）的共處理實驗，來驗證降解過程對VHL連接酶和蛋白酶體功能的依賴性。最后，他們對先導化合物的溶解性進行了評估，使用了磷酸鹽緩沖液和兩種模擬腸道環境的生物相關介質。

研究人員以化合物19作為結合M^pro的“彈頭”，在其暴露于溶劑的伯酰胺位點連接上不同長度和組成的 linker。這些 linker 的另一端則連接兩種最常用的E3連接酶的配體：一種是招募Von Hippel-Lindau (VHL) 連接酶的配體，另一種是招募 cereblon (CRBN) 連接酶的配體。最終，他們設計并合成了13個PROTAC分子（PROTACs 1-13），其中7個靶向VHL（1-7），6個靶向CRBN（8-13）。Linker的類型涵蓋了脂肪族、聚乙二醇鏈和含哌嗪的鏈，以探索結構-活性關系。

初步的生物學評估在Vero E6細胞中進行。所有化合物在高達125 μM濃度下均未顯示細胞毒性。抗SARS-CoV-2活性測試發現，在VHL系列中，PROTAC 1、5和6顯示出較好的抗病毒活性，其中PROTAC 1和6的半數有效濃度與先導化合物19相當。在CRBN系列中，PROTAC 8、9和10具有活性，其中PROTAC 8活性最強。值得注意的是，PROTAC 6在高達100 μM濃度下對M^pro的體外酶活幾乎沒有抑制能力，而其抗病毒活性卻與19相當，這提示它的作用機制可能不是抑制而是降解。

為了驗證活性PROTACs是否真能降解M^pro，研究者在SARS-CoV-2感染的293T-hACE2細胞中進行了蛋白質免疫印跡分析。在25 μM濃度下，PROTAC 1、6和8都能降低M^pro的蛋白水平，而無活性的PROTAC 7則不能。其中，PROTAC 6的效果最為顯著和可重復。進一步的濃度梯度實驗證實，PROTAC 6能以濃度依賴的方式降解M^pro，其DC₅₀（導致50%降解的濃度）為0.9 μM，在25 μM時最大降解率接近90%。

隨后的機制研究深入揭示了PROTAC 6的工作原理。微尺度熱泳動實驗證實，PROTAC 6確實能夠結合M^pro蛋白，盡管其結合親和力弱于先導化合物19。這印證了PROTAC技術的一個重要概念：即使是一個結合力較弱的“彈頭”，也有可能被成功改造成有效的降解劑。為了證明其降解作用依賴于所招募的E3連接酶，研究者使用了VHL連接酶的抑制劑VH298與PROTAC 6進行共處理。結果顯示，VH298的存在顯著削弱了PROTAC 6的降解能力，使其DC₅₀升高了3倍以上。同樣，當加入蛋白酶體抑制劑MG132時，M^pro的降解也被挽救。這些實驗共同證實，PROTAC 6的抗病毒活性是通過結合M^pro，招募VHL E3連接酶，進而利用細胞的泛素-蛋白酶體系統將其降解而實現的。

研究者進一步在更接近疾病狀態的人類肺腺癌細胞系Calu-3中評估了PROTAC 6的抗病毒效果。結果顯示，其EC₅₀為2.5 μM，活性優于作為陽性對照的Boceprevir。此外，PROTAC 6對地方性人類冠狀病毒HCoV-OC43也保持活性，證實了其潛在的廣譜抗冠狀病毒特性。與傳統的M^pro抑制劑（如化合物19）主要在病毒感染早期起效不同，PROTAC 6在病毒感染后較晚的時間點（如4或6小時）加入仍能抑制病毒復制，這與其通過降解已合成的病毒蛋白而起效的機制相符。

考慮到PROTAC類分子通常分子量大、水溶性差，研究者評估了PROTAC 6在不同介質中的溶解性。在普通的磷酸鹽緩沖液中，其溶解度極低。然而，在兩種模擬人體腸道環境的生物相關介質——模擬空腹狀態的FaSSIF和模擬餐后狀態的FeSSIF中，其溶解度顯著提高，尤其在FeSSIF中提高了超過1000倍。這一結果提示，PROTAC 6在體內的吸收可能比傳統水溶性測試預測的要好，為其進一步的開發提供了支持。

本研究成功設計并合成了一系列基于新型四氫苯并噻吩-吡唑并[1,5-a]嘧啶酰胺骨架的SARS-CoV-2 M^pro靶向PROTAC降解劑。其中，招募VHL E3連接酶的PROTAC 6脫穎而出，被證明是一個有效的M^pro降解劑。它在多種細胞模型（包括Vero E6、293T-hACE2和人類肺細胞Calu-3）中均表現出低微摩爾級的抗SARS-CoV-2活性，并能抑制HCoV-OC43，顯示了廣譜抗冠狀病毒的潛力。深入的機制研究表明，PROTAC 6通過結合M^pro并招募VHL連接酶，利用泛素-蛋白酶體系統誘導靶蛋白降解，從而實現抗病毒效果，而非直接抑制酶活性。這項工作的重要意義在于：首先，它擴展了抗病毒PROTAC的化學空間，證明基于相對弱效的M^pro結合劑也能開發出高效的降解劑，這為靶向更多“難以成藥”的病毒蛋白提供了新思路。其次，研究再次證實了PROTAC技術作為一種新型抗病毒策略的可行性，其催化性和可能克服耐藥性的特點，為應對未來可能出現的新發、再發冠狀病毒疫情提供了有前景的工具。最后，對先導化合物在生物相關介質中溶解度的積極評估，為其向臨床前及臨床階段的推進增添了信心。這項研究以“Discovery of a tetrahydrobenzothiophen-2-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3-carboxamide-based PROTAC as degrader of SARS-CoV-2 Main Protease”為題，發表于藥物化學領域的權威期刊《European Journal of Medicinal Chemistry》，為靶向蛋白降解技術在抗病毒領域的應用增添了有力的一筆。