《European Journal of Pharmacology》：A comparative and critical assessment of
in vitro strategies for the detection and generation of anastatic cell populations
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細(xì)胞凋亡晚期復(fù)蘇現(xiàn)象（anastasis）的檢測方法研究。傳統(tǒng)認(rèn)為執(zhí)行者caspase激活（如GC3AI熒光傳感器）是凋亡不可逆的“點(diǎn)”，但動(dòng)態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)該信號(hào)在晚期凋亡時(shí)反而減弱，導(dǎo)致誤判。本研究通過多參數(shù)時(shí)間序列成像，系統(tǒng)校準(zhǔn)GC3AI與PI染色，證實(shí)PI染色能更可靠區(qū)分凋亡晚期與復(fù)蘇狀態(tài)，解決方法學(xué)爭議，為研究細(xì)胞凋亡與復(fù)蘇機(jī)制提供新框架。
馬庫蘇德·阿里（Maqsood Ali）|維沙爾·巴蘇（Vishal Basu）|穆斯坎·坦瓦爾（Muskan Tanwar）|馬亨德拉·塞爾維（Mahendra Seervi）
印度新德里全印度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所（All India Institute of Medical Sciences，AIIMS）生物技術(shù)系
摘要
晚期凋亡的特點(diǎn)是線粒體外膜通透性增加（MOMP）和半胱天冬酶激活，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是不可逆的。然而，最近的研究描述了一種“逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象”（anastasis），即細(xì)胞在去除刺激后能夠從這種看似不可逆的狀態(tài)中恢復(fù)。然而，在逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象研究中，一個(gè)核心挑戰(zhàn)是準(zhǔn)確描述“不可逆的臨界點(diǎn)”，因?yàn)樘囟ǖ牡蛲鰳?biāo)志物（如細(xì)胞色素c的釋放或半胱天冬酶的激活）是動(dòng)態(tài)變化的，而不是二元的。這些標(biāo)志物的亞致死激活可能在應(yīng)激反應(yīng)的早期就發(fā)生，而從這一階段的恢復(fù)可能導(dǎo)致不同的結(jié)果，例如“凋亡失敗”。因此，準(zhǔn)確定義逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象需要定量評估凋亡標(biāo)志物，以將其與其他恢復(fù)現(xiàn)象區(qū)分開來。大多數(shù)研究依賴于基于熒光的半胱天冬酶生物傳感器信號(hào)來追蹤逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。僅檢測信號(hào)而不評估生物傳感器的動(dòng)態(tài)變化可能會(huì)導(dǎo)致對凋亡階段的誤解。在這項(xiàng)研究中，我們評估了晚期凋亡的標(biāo)志物，以確定一種可靠的方法來研究逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。通過多參數(shù)延時(shí)成像，我們發(fā)現(xiàn)基于GFP的半胱天冬酶-3樣蛋白酶活性指示劑（GC3AI）不能可靠地指示晚期凋亡。相比之下，我們發(fā)現(xiàn)碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色是一種可靠且可行的方法，可以生成逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的細(xì)胞群體。這項(xiàng)工作為研究逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象提供了一個(gè)框架，從而解決了方法上的模糊性，并為研究逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
引言
線粒體外膜通透性增加（MOMP）后執(zhí)行者半胱天冬酶的激活會(huì)引發(fā)細(xì)胞蛋白水解和DNA片段化，導(dǎo)致凋亡性細(xì)胞死亡（Bock和Tait，2020年）。盡管這一事件傳統(tǒng)上被認(rèn)為是不可逆的，或稱為“不可逆的臨界點(diǎn)”，但過去十年的研究對此觀點(diǎn)提出了挑戰(zhàn)（Green，2024年；Green和Amarante-Mendes，1998年；Nano等人，2023年）。許多研究表明，細(xì)胞可以從這一階段存活并恢復(fù)。獨(dú)立的研究將這些恢復(fù)現(xiàn)象稱為“逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象”、“部分殺傷”和“凋亡失敗”等（Ballweg等人，2017年；Ichim等人，2015年；Liu等人，2015年；Seervi等人，2019年）。新興的研究表明，這些恢復(fù)現(xiàn)象與癌癥患者的不良預(yù)后有關(guān)，因?yàn)檫@些恢復(fù)過程會(huì)促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性和致癌轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致藥物抵抗、轉(zhuǎn)移和癌癥復(fù)發(fā)（Liu等人，2015年；Mohammed等人，2022年；Sun等人，2020年；Wang等人，2022年）。
在這些報(bào)道的細(xì)胞恢復(fù)現(xiàn)象中，逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象可能是唯一被明確驗(yàn)證為從凋亡“不可逆臨界點(diǎn)”中逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。這一途徑已在多種細(xì)胞類型中得到了廣泛研究，包括在果蠅（Drosophila）中的體內(nèi)研究（Ding等人，2016年；Sun等人，2020年；Tang等人，2009年）。逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象首次在2012年被描述，是一種罕見的現(xiàn)象，即細(xì)胞在去除凋亡刺激后可以從晚期凋亡中恢復(fù)。即使在細(xì)胞表現(xiàn)出晚期凋亡的特征（包括MOMP、執(zhí)行者半胱天冬酶活性和DNA片段化）之后，這種恢復(fù)仍然會(huì)發(fā)生（Seervi等人，2019年；Tang等人，2012年；Wang等人，2022年）。盡管對逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的研究有所進(jìn)展，但準(zhǔn)確追蹤逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的細(xì)胞仍然很困難。一個(gè)主要挑戰(zhàn)是，晚期凋亡的標(biāo)志物（如半胱天冬酶-3/7的激活）是動(dòng)態(tài)變化的，而不是二元的。動(dòng)力學(xué)研究表明，半胱天冬酶-3的水平逐漸增加，只有在晚期凋亡時(shí)才會(huì)達(dá)到導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵閾值（Florentin和Arama，2012年；Ford等人，2015年；Roux等人，2015年）。因此，研究逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象需要為這些標(biāo)志物設(shè)定定量閾值，以將其與其他恢復(fù)現(xiàn)象區(qū)分開來（Nano和Montell，2024年）。例如，亞致死的半胱天冬酶-3活性通常是由于有限的MOMP引起的，這會(huì)釋放出不足以觸發(fā)致命半胱天冬酶激活的促凋亡蛋白（如細(xì)胞色素c）。修復(fù)了由此造成的損傷的細(xì)胞可以存活并繼續(xù)增殖；這種現(xiàn)象被稱為“凋亡失敗”（Berthenet等人，2020年；Cartwright等人，2017年）。這種凋亡閾值不是固定的，而是受線粒體敏感性等因素的影響。因此，“不可逆的臨界點(diǎn)”是動(dòng)態(tài)變化的，取決于細(xì)胞的整體狀態(tài)，而不僅僅是半胱天冬酶活性的啟動(dòng)（Albeck等人，2008年；Bagci等人，2006年；Rehm等人，2006年）。因此，認(rèn)為新興的執(zhí)行者半胱天冬酶激活是晚期凋亡的確定標(biāo)志物的觀點(diǎn)正受到越來越多的質(zhì)疑（Bagci等人，2006年；Nano等人，2023年）。這一不斷發(fā)展的觀點(diǎn)得到了短暫激活的半胱天冬酶的非凋亡生理功能的支持。事實(shí)上，低水平、短暫或細(xì)胞內(nèi)限制的半胱天冬酶活性可以促進(jìn)重要的細(xì)胞過程。例如，在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞和果蠅神經(jīng)前體細(xì)胞中，短暫的半胱天冬酶活性有助于細(xì)胞命運(yùn)的決定，而不會(huì)引發(fā)凋亡。同樣，半胱天冬酶活性也有助于細(xì)胞骨架重組、免疫反應(yīng)和細(xì)胞間通信（Ding等人，2016年；Fernando等人，2005年；Fujita等人，2008年；Geisbrecht和Montell，2004年）。因此，僅檢測到活躍的半胱天冬酶并不能確定細(xì)胞已經(jīng)走向死亡。
多項(xiàng)體外和體內(nèi)研究表明，使用半胱天冬酶生物傳感器、熒光半胱天冬酶底物和碘化丙啶等膜不透染料等工具，細(xì)胞在短暫暴露于凋亡刺激后會(huì)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象（Seervi等人，2019年；Tang等人，2012年；Xu等人，2018年）。然而，當(dāng)前的方法主要使用熒光生物傳感器來可視化半胱天冬酶-3/7的活性。這些傳感器包括基于轉(zhuǎn)位和FRET的報(bào)告分子（例如Apoliner，SCAT3）、環(huán)狀置換熒光蛋白（例如GC3AI，F(xiàn)lipGFP）和轉(zhuǎn)錄報(bào)告分子（例如CaspaseTracker）（Bardet等人，2008年；Takemoto等人，2003年；Zhang等人，2013年）。然而，這些傳感器的信號(hào)動(dòng)態(tài)或閾值尚未被量化，無法精確定義凋亡的階段。沒有這種評估，就無法區(qū)分晚期凋亡和早期凋亡階段（Nano等人，2023年）。
因此，我們評估了當(dāng)前體外方法生成逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象癌細(xì)胞群體的有效性。通過系統(tǒng)地校準(zhǔn)半胱天冬酶-3生物傳感器（GC3AI）與其他晚期凋亡標(biāo)志物，我們確定了其在檢測晚期凋亡方面的可靠性。這項(xiàng)分析揭示了GC3AI功能動(dòng)態(tài)的固有局限性，特別是在晚期凋亡細(xì)胞中信號(hào)的丟失。我們進(jìn)一步評估了將GC3AI與碘化丙啶（PI）結(jié)合使用的雙參數(shù)方法的可行性。這些發(fā)現(xiàn)完善了逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的研究方法，并挑戰(zhàn)了僅依賴半胱天冬酶生物傳感器來追蹤逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象細(xì)胞群體的做法。
部分內(nèi)容摘錄
試劑
依托泊苷（Etoposide）、順鉑（cisplatin）和乙醇從Sigma-Aldrich（美國）獲得，而泛半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK和碘化丙啶（PI）染色劑從Santa Cruz Biotechnology（美國）購買。FluoroBrite DMEM、GlutaMAX、半胱天冬酶-3/7紅色熒光底物、Lipofectamine LTX Plus、DAPI核染色劑、ProLong Diamond mounting介質(zhì)和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒從Thermo Fisher Scientific（美國）購買。Puromycin從MedChemExpress（美國）采購。
基于基因編碼的半胱天冬酶-3活性熒光生物傳感器（GC3AI）在研究逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象中的用途
執(zhí)行者半胱天冬酶的激活，特別是半胱天冬酶-3的激活，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是凋亡的“不可逆臨界點(diǎn)”（Kritskaya等人，2025年）。因此，逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象是通過證明細(xì)胞在執(zhí)行者半胱天冬酶激活后的恢復(fù)來確立的。盡管存在各種熒光探針和染料，但只有少數(shù)幾種，如基于熒光蛋白的生物傳感器（例如GC3AI，mCasExpress）和CellEvent?半胱天冬酶-3/7熒光底物，被用于生成和研究逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象
討論
半胱天冬酶生物傳感器的進(jìn)步促進(jìn)了凋亡和逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的研究；然而，對這些工具的依賴揭示了一個(gè)重大限制：僅基于半胱天冬酶活性來定義“不可逆臨界點(diǎn)”的難度。在逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的背景下，區(qū)分晚期凋亡和早期凋亡的恢復(fù)是至關(guān)重要的（Ding等人，2016年；Nano等人，2023年；Sun等人，2020年，2017年，2023年）。為了避免誤解，研究人員必須
結(jié)論
總之，本研究系統(tǒng)地評估了當(dāng)前生成逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象細(xì)胞群體的方法，并指出了半胱天冬酶生物傳感器在定義晚期凋亡方面的關(guān)鍵局限性。通過多參數(shù)延時(shí)成像，我們發(fā)現(xiàn)GC3AI生物傳感器的信號(hào)在膜通透性增加之前或同時(shí)經(jīng)常減弱，這一點(diǎn)通過碘化丙啶的吸收得到了證實(shí)。因此，GC3AI+部分主要代表了
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
馬庫蘇德·阿里（Maqsood Ali）：方法學(xué)、研究、概念化。穆斯坎·坦瓦爾（Muskan Tanwar）：方法學(xué)。維沙爾·巴蘇（Vishal Basu）：寫作——審閱與編輯、初稿撰寫、驗(yàn)證、概念化。馬亨德拉·塞爾維（Mahendra Seervi）：監(jiān)督、資金獲取、概念化
手稿準(zhǔn)備過程中使用生成式AI和AI輔助技術(shù)的聲明
在準(zhǔn)備這項(xiàng)工作時(shí)，作者使用了Grammarly工具來糾正語法和句子。使用該工具/服務(wù)后，作者根據(jù)需要審查和編輯了內(nèi)容，并對出版物的內(nèi)容負(fù)全責(zé)。
利益沖突聲明
? 作者聲明以下可能被視為潛在利益沖突的財(cái)務(wù)利益/個(gè)人關(guān)系：Seervi Mahendra報(bào)告稱獲得了印度政府科技部（ANRF）的財(cái)務(wù)支持。Seervi Mahendra與全印度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所（AIIMS）存在雇傭關(guān)系。如果有其他作者，他們聲明沒有已知的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系
致謝
作者M(jìn). Seervi感謝印度政府科技部（編號(hào)CRG/2020/002009）和AIIMS的早期職業(yè)內(nèi)部研究基金（編號(hào)A-1017）提供的財(cái)務(wù)支持。我們還要感謝AIIMS的FACS設(shè)施、CCRF以及生物技術(shù)系的Vineet Choudhary博士對流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡使用的支持。此外，作者M(jìn). Ali還感謝
