《Genes & Diseases》：Single-cell RNA sequencing reveals FOLR2+ macrophages interaction with HSPA6+ NSCLC cells via CCL2/ICAM-1 in malignant pleural effusion and promotes
EGFR-TKI resistance
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EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥是非小細胞肺癌（NSCLC）臨床治療的重要瓶頸。本研究對患者惡性胸腔積液和血液樣本進行單細胞RNA測序，解析了耐藥后腫瘤微環境的細胞組成與互作網絡，揭示了FOLR2+的M2樣巨噬細胞通過CCL2/ICAM-1通路與具有干細胞特性的HSPA6+癌細胞互作，共同驅動奧希替尼耐藥。該發現為理解EGFR-TKI耐藥新機制提供了視角，并為逆轉耐藥提供了潛在治療靶點。
肺癌是全球范圍內死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占據了絕大多數病例。對于攜帶表皮生長因子受體（EGFR）突變的患者而言，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）如奧希替尼，已成為一線標準治療，顯著延長了患者的生存期。然而，一個殘酷的現實是，幾乎所有患者最終都會對藥物產生耐藥，導致疾病進展。盡管科學家們已發現部分耐藥機制，如EGFR基因的二次突變或旁路信號激活，但耐藥的發生具有高度的異質性，許多謎團仍未解開。尤其是在肺癌患者常見的并發癥——惡性胸腔積液（MPE）中，腫瘤細胞、免疫細胞等多種成分共存的特殊微環境，被認為是研究耐藥機制的“富礦”，但其在EGFR-TKI耐藥中的具體作用尚不清晰。為了深入探索耐藥背后的細胞與分子全景，一項發表于《Genes》雜志的研究，利用前沿的單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術，為我們揭開了惡性胸腔積液中一場驅動耐藥的關鍵細胞“對話”。
本研究采用了多項關鍵技術來解析耐藥微環境。研究人員收集了8名非小細胞肺癌患者（2名治療前，6名奧希替尼耐藥后）的惡性胸腔積液和外周血單個核細胞（PBMC）樣本。核心分析基于10x Genomics平臺的單細胞RNA測序，通過Seurat軟件包進行數據質控、整合、降維和細胞聚類分析。利用inferCNV算法通過拷貝數變異（CNV）評分鑒定惡性上皮細胞。細胞間通訊分析借助CellPhoneDB和NicheNet工具預測配體-受體互作。此外，研究還結合了體外細胞共培養、蛋白質免疫印跡（Western Blot）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、CCK-8細胞活性檢測、腫瘤球形成實驗以及多重免疫組化等技術進行功能驗證。
研究結果
奧希替尼耐藥后NSCLC的全局細胞圖譜
通過對75,487個高質量單細胞的分析，研究繪制了耐藥前后的細胞組成變化。結果顯示，在惡性胸腔積液中，耐藥后CD4+T細胞、自然殺傷（NK）細胞和髓系細胞比例增加，而樹突狀細胞比例降低。在外周血中，CD4+T細胞比例也增加，但NK細胞比例下降。這表明耐藥導致了局部（胸腔積液）和系統（血液）免疫微環境的顯著重塑。
惡性胸腔積液中惡性上皮細胞亞群的鑒定
通過CNV分析，研究人員從上皮細胞中鑒定出多個惡性亞群，并命名為malignant_CCL5、malignant_HSPA6等。其中，malignant_HSPA6亞群在奧希替尼耐藥組中顯著富集。軌跡分析和CytoTRACE評分顯示，該亞群處于發育軌跡的起點，具有更高的干細胞特性（stemness）。基因集富集分析（GSEA）提示其功能與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/核因子κB（NF-κB）信號通路相關。更重要的是，以該亞群前15個標志物構成的基因標簽，在TCGA肺腺癌隊列中預示了更差的預后。
PBMC和MPE中巨噬細胞亞型的多樣性
對髓系細胞的深入分析揭示了9個巨噬細胞/單核細胞亞群。值得注意的是，一個表達葉酸受體2（FOLR2）的亞群——Macro_FOLR2，在耐藥組的惡性胸腔積液中顯著增多。表型評分顯示Macro_FOLR2表現出更強的M2樣巨噬細胞特征。GSEA分析表明其功能與體液免疫應答和上皮細胞增殖相關，提示它可能參與調節腫瘤微環境。
MPE中巨噬細胞與上皮細胞的相互作用
鑒于Malignant_HSPA6具有干細胞特性，而Macro_FOLR2可能調節上皮細胞增殖，研究人員推測兩者間存在通訊。細胞互作分析（CellPhoneDB）證實，在所有的惡性上皮亞群中，Malignant_HSPA6是與Macro_FOLR2相互作用最強的亞群。進一步的配體-受體分析（NicheNet）預測，Macro_FOLR2可能通過分泌CCL2（也稱為MCP-1）來作用于Malignant_HSPA6細胞，而ICAM-1（細胞間粘附分子-1）可能是CCL2下游的一個關鍵靶基因。
Macro_FOLR2通過CCL2/ICAM-1通路調控Malignant_HSPA6 NSCLC細胞以促進奧希替尼耐藥
為了驗證上述預測，研究團隊構建了穩定過表達HSPA6的肺癌PC-9細胞株和過表達FOLR2的THP-1（單核細胞）細胞株進行體外共培養。功能實驗表明，HSPA6過表達本身就能促進PC-9細胞的干細胞特性和奧希替尼耐藥。當與FOLR2過表達的THP-1細胞共培養時，PC-9細胞對奧希替尼的耐藥性進一步增強，遷移和增殖能力也提高。機制上，共培養體系上清液中的CCL2水平顯著升高，并且PC-9細胞中的ICAM-1蛋白表達上調。通過添加外源性重組CCL2蛋白，可以模擬共培養的效果，增強耐藥性；而使用CCL2特異性抑制劑bindarit或敲低ICAM-1的表達，則能逆轉這種耐藥表型。
CCL2/ICAM-1在奧希替尼耐藥NSCLC患者的MPE中表達
臨床樣本分析進一步支持了上述發現。ELISA檢測顯示，耐藥患者惡性胸腔積液中的CCL2水平顯著高于敏感患者。多重免疫組化結果直觀表明，在耐藥患者的惡性胸腔積液樣本中，Macro_FOLR2巨噬細胞的密度以及CCL2和ICAM-1的蛋白表達均明顯上調。
研究結論與意義
本研究通過高分辨率的單細胞測序技術，系統描繪了EGFR突變型非小細胞肺癌患者對奧希替尼耐藥后，其惡性胸腔積液這一特殊腫瘤微環境中發生的深刻變化。研究不僅鑒定出一個與不良預后相關的、具有干細胞特性的惡性上皮細胞亞群（Malignant_HSPA6），還發現了一個在耐藥環境中富集的M2樣巨噬細胞亞群（Macro_FOLR2）。最關鍵的是，研究揭示了這兩個細胞群體之間存在一條以前未知的促耐藥“對話”通路：Macro_FOLR2巨噬細胞通過分泌CCL2，作用于Malignant_HSPA6腫瘤細胞，上調其ICAM-1的表達，進而共同增強腫瘤的干細胞特性、遷移增殖能力，并最終導致對奧希替尼的耐藥。
這一發現具有多重重要意義。首先，它從腫瘤微環境中細胞互作的新視角，闡明了EGFR-TKI耐藥的一種全新機制，豐富了我們對耐藥異質性的理解。其次，研究將CCL2/ICAM-1軸鎖定為連接免疫細胞（巨噬細胞）與腫瘤細胞（上皮細胞）功能的關鍵樞紐，為逆轉耐藥提供了潛在的治療靶點。例如，使用CCL2抑制劑（如bindarit）或靶向ICAM-1的策略，有望與現有的EGFR-TKI藥物聯合使用，以克服或延緩耐藥的發生。最后，該研究再次凸顯了惡性胸腔積液作為反映體內真實腫瘤微環境“窗口”的重要價值，以及單細胞測序技術在解析復雜生物過程、發現新機制方面的強大能力。盡管未來仍需在更大規模的隊列和動物模型中進行驗證，但這項研究無疑為攻克非小細胞肺癌的靶向治療耐藥難題，開辟了一條充滿希望的新路徑。
