《Hormones and Behavior》：Acute and chronic extreme cold weather events influence hypothalamic and testicular gene networks in a free-living Arctic breeding songbird, the Lapland longspur
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北極云雀在極端天氣下的繁殖期HPG/HPA軸激素調控及基因表達網絡研究，通過對比2013年慢性低溫與2016年典型及暴風雪天氣下的生理響應，發現抵達期低溫導致性腺抑制和HPA軸激活，孵卵期暴風雪僅引起HPA軸應激反應，且網絡共表達結構隨環境壓力動態重組。
Jesse S. Krause | Angus M.A. Reid | Jonathan H. Pérez | Jeffrey C. Cheah | Valerie R. Bishop | Violeta Trejo-Reveles | Alex R. Johnston | John C. Wingfield | Simone L. Meddle
內華達大學里諾分校生物系，美國內華達州89557
摘要
本研究探討了雄性拉普蘭長刺雀（Calcarius lapponicus）在繁殖階段特有的內分泌表型及其對急性和慢性極端天氣反應的調控機制。在2013年春季極端寒冷的季節，這些鳥類在到達阿拉斯加繁殖地的時間延遲后被采集。而在2016年，當天氣條件正常時，我們在它們到達繁殖地以及孵化期間（無論是否遭遇暴風雪）對它們進行了采集。我們量化了下丘腦和性腺的基因表達、類固醇激素以及睪丸體積，以表征不同繁殖階段的激活和抑制信號通路。在鳥類到達繁殖地時，網絡共表達模式具有很強的結構特征，下丘腦、睪丸抑制和睪丸激活信號模塊之間存在明顯的功能分離。在孵化期間，這種功能分離減弱，在極端寒冷條件下則完全消失，反映出模塊間的整合程度增加。從到達繁殖地到孵化的轉變過程中，邊緣水平的共表達發生了顯著重組，表明激素和基因之間的連接發生了變化。在正常條件下，從到達繁殖地到孵化的轉變伴隨著下丘腦促性腺激素抑制激素（GnIH）和芳香化酶、促性腺激素受體、類固醇生成酶以及循環中睪酮水平的下降，而睪丸中的皮質類固醇信號相關基因則保持穩定。在到達繁殖地時遭遇的長期寒冷天氣則導致下丘腦中的2型脫碘酶和雌激素受體水平升高，同時降低下丘腦中的GnIH、睪丸體積和血漿睪酮水平。孵化期間的暴風雪導致下丘腦中的TSHβ和芳香化酶水平升高，但睪丸未發生明顯變化。我們的研究為了解極端天氣如何影響野生動物的內分泌表型提供了新的見解。
引言
在氣候變化迅速、極端天氣事件頻率不斷增加的背景下，動物面臨著可能考驗其行為和生理適應能力的環境挑戰（Smith, 2011; Wingfield et al., 2017）。有許多記錄顯示，當地鳥類種群因無法應對極端天氣而出現繁殖失敗（Martin and Wiebe, 2004）。下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸整合了初始信號（如光周期）和補充信號（如食物可用性、社會信息等），以微調繁殖開始的時間或在中斷繁殖嘗試后重新啟動繁殖（Wingfield, 2008）。下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸對于應對不可預測的事件（如風暴）至關重要，并能抑制HPG軸的活動（Wingfield and Sapolsky, 2003）。在HPG軸的背景下，理解以下兩種情況下的內分泌變化至關重要：1）在繁殖階段正常過渡期間；2）在這些階段中發生急性或慢性寒冷天氣時。
對于長日照繁殖的動物而言，繁殖軸在日照時間延長時被激活，這一過程通過局部甲狀腺激素信號級聯反應實現，涉及甲狀腺刺激激素β（TSHβ）以及2型和3型脫碘酶（DiO2和DiO3）的相互作用，從而解除對促性腺激素釋放激素（GnRH-1）分泌的抑制。GnRH-1和促性腺激素抑制激素（GnIH）調節垂體前葉釋放的促黃體生成激素（LH）和卵泡刺激激素（FSH）（Dawson, 2015; Wingfield et al., 2016）。這些促性腺激素促進性腺的復蘇、精子生成以及雄性激素睪酮和雌性激素雌二醇的合成。睪酮的合成需要一系列酶的參與，包括膽固醇酯酶（CEase）、類固醇生成急性調節蛋白（StAR）、側鏈裂解酶（SCC）、3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）、17/20裂解酶和17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD）（Tremblay, 2015）。睪酮和雌二醇通過作用于大腦中的受體來刺激繁殖行為，如鳴叫、領地攻擊性、交配等。此外，睪酮和雌二醇還通過負反饋機制調節HPG軸的活動，以限制其活性（Lawson et al., 2001）。
在面臨惡劣條件時，HPA軸被激活，導致糖皮質激素（如皮質酮）水平升高，后者可通過復雜的細胞信號系統抑制HPG軸。局部表達的皮質類固醇結合球蛋白（CBG）可以調節皮質酮向目標組織細胞的輸送（Schoech et al., 2013; Sun et al., 2018）。此外，11β-羥基類固醇脫氫酶1型（11β-HSD1）可增加細胞內皮質酮濃度，而11β-羥基類固醇脫氫酶2型（11β-HSD2）則降低其濃度（Chapman, Holmes & Seckl 2013）。基因表達最終受細胞內糖皮質激素受體（GR；低親和力）和鹽皮質激素受體（MR；高親和力）的調控（MR; de Kloet, 2014）。FK506結合蛋白51（FKBP5）可以與GR和熱休克蛋白90（HSP90）在細胞質中形成復合物，從而抑制GR的信號傳導和活性（Zimmer et al., 2020）。皮質酮的最終信號效應包括降低下丘腦中的GnRH水平以及提高下丘腦和睪丸中的GnIH含量（Calisi et al., 2008; Kirby et al., 2009），進而抑制睪丸中的睪酮和精子生成（McGuire and Bentley, 2010）。多項近期研究表明，鳥類性腺中的基因表達在急性寒冷壓力、應對壓力或皮質酮植入等情況下會發生廣泛變化（Lipshutz et al., 2022, Calisi et al., 2018, Austin et al., 2021）。
幸運的是，我們能夠在阿拉斯加北極地區，研究雄性拉普蘭長刺雀（Calcarius lapponicus）在自然繁殖階段表型和行為轉變過程中，以及它們如何受到急性和慢性寒冷天氣事件的影響。拉普蘭長刺雀被歸類為北極特化物種，因為它們是繁殖范圍最北的鳴禽之一。因此，它們為研究一個正在積極適應全球變化最快地區的物種提供了獨特的機會。它們的繁殖地到達時間、領地行為的開始以及筑巢行為受到春季天氣條件和暴風雪的顯著影響（Custer and Pitelka, 1977; Fox et al., 1987; Boelman et al., 2017）。它們的繁殖窗口非常短暫，且與雄性激素水平的升高相關，這些激素促進了領地攻擊性、空中展示和交配行為（Hunt et al., 1995; Hunt et al., 1997）。當雌性從產卵過渡到孵化期間，雄性體內的雄性激素水平會迅速下降（Hunt et al., 1995; Hunt et al., 1997）。然而，為了生存，它們的生理和行為必須迅速適應寒冷天氣（Wingfield and Sapolsky, 2003）。在布魯克斯山脈東北部地區，5月底和6月初由于暴風雪導致的繁殖中斷頻率正在上升，因為暴風雪發生的時間和頻率都在增加（Tape et al., 2016; Krause et al., 2018）。
在本研究中，我們在繁殖季節的四個不同時間點采集了組織和血液樣本，以量化基因表達、血漿皮質酮和睪酮濃度以及睪丸體積的變化。2013年，我們在一個極端寒冷且持續降雪的時期采集了雄性拉普蘭長刺雀樣本（Krause et al., 2016; Boelman et al., 2017）。長時間的極端寒冷導致它們向北遷徙的時間推遲了3-6天，繁殖地面臨溫度挑戰和食物短缺，結果拉普蘭長刺雀的體重、脂肪含量、血細胞比容和肌肉狀況均有所下降（Krause et al., 2016）。此外，拉普蘭長刺雀在基線和應激狀態下的皮質酮水平升高，這可能有助于調動能量儲備以應對寒冷天氣的需求（Krause et al., 2016）。2016年，當天氣和融雪情況更符合北極典型特征時，我們在它們到達繁殖地和孵化期間采集了樣本，此時它們的整體身體狀況良好（Krause et al., 2018）。最后，在2016年，我們還在孵化期間的一次多日暴風雪中采集了樣本，這次暴風雪導致鳥類放棄了巢穴，形成了50-100只的大群，并導致90%的繁殖失敗率（Krause et al., 2018）。暴風雪導致拉普蘭長刺雀的應激誘導皮質酮水平升高，但基線水平未受影響（Krause et al., 2018）。
圖1總結了本研究中核心的調控通路，這些通路控制著繁殖軸的激活和抑制。我們通過以下方法來表征不同繁殖階段及應對寒冷天氣事件時激素和基因表達的變化：1）單變量方法來確定基因特異性差異；2）線性判別分析（LDA）來確定是否存在不同的內分泌表型；3）網絡分析來理解基因和激素之間的表型相關性和連接性。我們預測，在鳥類到達繁殖地期間，與HPG軸和HPA軸相關的基因表達會最高，因為HPG軸的激活先于產卵，而HPA軸在決定繁殖開始時間中起關鍵作用。在寒冷天氣事件期間，我們預計HPA軸活性會升高，而HPG軸活性會受到抑制。由于這些復雜的表達模式，我們預計會觀察到不同的表型和基因網絡。最后，我們預測寒冷天氣事件會升高皮質酮水平，并降低睪酮和睪丸質量。
研究物種
我們在美國阿拉斯加布魯克斯山脈北坡的Toolik研究站附近研究了雄性拉普蘭長刺雀（Calcarius lapponicus），該研究站位于北緯68°38′、西經149°36′。在我們的研究地點，太陽在5月22日出，直到7月21日才落山，因此所有樣本都是在持續日照的環境中采集的。盡管有24小時的光照，拉普蘭長刺雀仍表現出晝夜節律性的行為和褪黑素分泌模式。
睪丸體積
不同繁殖階段的睪丸體積存在差異（F3,29 = 3.71, P = 0.02，圖2A）。在典型條件下，從到達繁殖地到孵化期間睪丸體積沒有變化。然而，長期極端寒冷導致到達繁殖地時的睪丸體積降低（t = 2.81, P = 0.04, Cohen's D = 1.42），而在孵化期間發生的暴風雪對睪丸體積沒有影響（t = 1.50, P = 0.44, Cohen's D = 0.72）。
血漿睪酮
不同繁殖階段的血漿睪酮濃度存在差異（F3,29 = 21.32, P
討論
我們首次在任何野生自由生活動物中總結了急性和慢性極端天氣對繁殖期間大腦和睪丸的影響。極端寒冷天氣與春季遷徙同時發生，導致拉普蘭長刺雀的生理、形態和行為發生顯著變化（Krause et al., 2016; Boelman et al., 2017）。到達繁殖地時的極端寒冷條件導致睪丸體積減小和睪酮水平下降。我們還發現……
結論
在不斷變化的世界中，迫切需要了解野生動物種群對極端天氣事件的機制性反應。這是首篇發表的研究，描述了自由生活的野生動物如何通過睪丸形態、循環激素和基因表達的變化來應對極端天氣事件。HPG軸的每個層次都經歷了基因mRNA表達的變化，這些變化可以解釋血漿睪酮和睪丸水平的觀察差異。
作者貢獻聲明
Jesse S. Krause：撰寫——審稿與編輯、初稿撰寫、驗證、資源獲取、項目管理、方法學設計、研究實施、資金申請、數據分析、數據管理、概念構建。Angus M.A. Reid：驗證、研究實施、數據分析、數據管理。Jonathan H. Pérez：撰寫——審稿與編輯、研究實施、數據分析、數據管理、概念構建。Jeffrey C. Cheah：研究實施、數據管理。Valerie R. Bishop：數據分析
作者貢獻
JSK、JCW和SLM設計了研究并獲得了資金支持。JSK、SLM、JHP和JCW進行了野外工作和組織采集。JSK、JCC、AMAR、VB、VTR、ARJ和JHP進行了分子實驗室工作、引物設計和檢測方法驗證。JSK進行了數據分析并撰寫了論文。所有作者對論文提供了重要反饋，同意對論文內容負責。
利益沖突聲明
無。
致謝
本研究得到了美國國家科學基金會極地項目辦公室ARC 0909133和綜合有機體系統項目IOS 1558049的支持，以及英國生物技術和生物科學研究委員會對Simone L. Meddle的戰略資助（BB/P013759/1, BBS/E/RL/230001C, BB/V001647/1）。我們還要感謝Helen E. Chmura和Caroline Newell在野外工作中的所有幫助。
