摘要

背景

闡明腫瘤發生和治療抵抗的分子機制對于開發有效的治療方法至關重要。雌激素受體α（ERα）信號在ER⁺乳腺癌中的破壞是內分泌抵抗的關鍵驅動因素，因此需要更深入地了解其調控機制。microRNA-375（miR-375）已被確定為一種依賴于具體環境的調節因子，在不同類型的癌癥中既可作為致癌基因也可作為腫瘤抑制因子。本研究旨在探討miR-375在乳腺癌進展和他莫昔芬抵抗中的作用。

方法

使用定量逆轉錄PCR（qRT-qPCR）檢測乳腺癌組織和細胞系中的miR-375表達水平。通過Kaplan–Meier繪圖儀分析了miR-375表達與乳腺癌患者總生存期之間的相關性。通過體外和體內功能獲得/喪失實驗評估了miR-375在乳腺癌和他莫昔芬敏感性中的作用。利用雙熒光素酶報告基因實驗、免疫沉淀（IP）、免疫熒光（IF）和泛素化分析研究了miR-375–UBE3A–ERα信號軸的分子機制。

結果

與ER^?樣本相比，ER⁺乳腺癌組織中的miR-375表達顯著升高。miR-375水平高的患者總體生存期明顯較差。miR-375的過表達增強了ERα蛋白的穩定性，從而導致惡性表型的出現，包括增殖能力增強、遷移能力增強、侵襲性增強以及他莫昔芬抵抗性增強，同時凋亡減少。在miR-375敲低后，這些表型效應得到了逆轉。從機制上講，miR-375的直接靶標UBE3A通過泛素-蛋白酶體途徑促進了ERα的降解。

結論

本研究揭示了miR-375–UBE3A–ERα軸在乳腺癌進展和他莫昔芬抵抗中的作用。靶向miR-375可能是一種有前景的策略，用于克服ER⁺乳腺癌的內分泌抵抗。

引言

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，占全球新診斷病例的約32%和癌癥相關死亡的14%[1]。大約70%的乳腺癌是雌激素受體α（ERα）陽性的，而與雌激素結合的ERα在ER⁺乳腺癌中驅動細胞增殖中起著關鍵作用。目前，他莫昔芬作為一種選擇性雌激素受體調節劑（SERM），仍然是ER⁺乳腺癌的一線治療方法[2]。他莫昔芬通過競爭性結合雌激素受體來發揮抗腫瘤作用，從而阻斷雌二醇（E2）的增殖作用。然而，對他莫昔芬的原始抵抗和獲得性抵抗都帶來了重大的臨床挑戰[3],[4]。因此，闡明他莫昔芬抵抗的分子機制對于改進內分泌治療策略至關重要。 microRNA（miRNAs）是一類內源性、非編碼的單鏈RNA，長度約為21–23個核苷酸。它們通過結合目標mRNA的3′非翻譯區（UTR）來調節基因表達，導致翻譯抑制或mRNA降解[5]。異常的miRNA表達與多種疾病有關，包括癌癥[6]。大量研究表明，miRNAs可以根據細胞環境的不同，起到致癌基因或腫瘤抑制因子的作用， 從而調節腫瘤生長和轉移[7],[8]。我們之前的研究揭示了miR-375在肺癌和前列腺癌中的環境依賴性作用。具體來說，強制表達miR-375會上調雄激素受體（AR）的表達，同時下調凋亡標志物，從而促進前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲性增強和恩雜魯胺抵抗，并抑制凋亡[9],[10]。早期研究將miR-375描述為乳腺腫瘤抑制因子，表明它通過SHOX2等靶點抑制上皮-間質轉化并降低乳腺癌細胞的存活率，從而抑制惡性表型[11]。相比之下，后續在ER⁺乳腺癌細胞中的研究表明，miR-375在表觀遺傳學上被上調，并與ERα形成正反饋循環，促進雌激素依賴性的轉錄和細胞增殖，提示其具有致癌功能[12]。這些看似矛盾的結論可能反映了實驗環境的差異，特別是ER狀態和所檢測的生物學終點不同，腫瘤抑制效應主要在ER獨立的條件下報告，而致癌效應主要在ER⁺模型中觀察到。同樣，據報道miR-375在他莫昔芬抵抗的乳腺癌細胞中下調，而重新表達miR-375可以增強藥物敏感性，表明其在內分泌抵抗中的作用具有環境依賴性[13]。系統綜述強調了miRNA介導的他莫昔芬抵抗的異質性和多因素性質，不同的miRNAs表現出特定的環境效應[14]。盡管取得了這些進展，但miR-375調節ER⁺乳腺癌的機制基礎及其對內分泌治療抵抗（尤其是他莫昔芬抵抗）的潛在貢獻仍不明確。為了填補這一空白，本研究系統地探討了miR-375在ER⁺乳腺癌中的作用，重點關注其對ERα穩定性和他莫昔芬的調控。 在miRNAs調控的多種途徑中，蛋白質穩態的轉錄后控制——特別是像類固醇激素受體這樣的關鍵驅動因子的降解途徑——正成為癌癥進展中的一個關鍵環節。維持類固醇激素受體的蛋白質穩態對正常的生理功能和疾病調節至關重要。針對受體降解的治療策略在治療激素依賴性癌癥（如乳腺癌和前列腺癌）中顯示出希望。蛋白質穩定性升高是乳腺癌中ERα積累的一個促成因素。參與ERα降解的主要途徑之一是泛素化——這一過程由三種酶級聯調控：E1泛素激活酶、E2泛素結合酶和E3泛素連接酶。E3連接酶通過催化泛素C末端甘氨酸與目標蛋白賴氨酸殘基之間的異肽鍵的形成來介導底物特異性[15]。已有多種E3連接酶被鑒定為ERα降解的介質，包括NEDD4[16]、Hbo1[17]、SPOP[18]、E6AP[19]。此外，RING型E3連接酶，如RNF181[20]、TRIM4[21]、RNF31[22]，也被報道可以調節ERα表達并影響乳腺癌的進展。 在這項研究中，我們觀察到高水平的miR-375與ER⁺乳腺癌患者的不良預后相關，而與ER^?患者無關。功能實驗表明，miR-375的過表達在體外和體內都促進了腫瘤細胞的增殖并誘導了他莫昔芬抵抗。因此，本研究旨在闡明miR-375調節ERα信號和他莫昔芬抵抗的機制，特別關注識別參與ERα蛋白降解的新下游效應因子。UBE3A與ERα相互作用，并在乳腺癌細胞中促進其通過泛素介導的降解。總體而言，我們的發現揭示了他莫昔芬抵抗背后的一個新分子機制，并表明靶向miR-375可能是一種有前景的方法，用于增強ER⁺乳腺癌的內分泌治療。

細胞培養

正常乳腺上皮細胞系MCF-10 A和乳腺癌細胞系（T47D、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231、BT-549和MDA-MB-468）來自黑龍江省癌癥研究所（中國哈爾濱），并按照先前描述的方案進行培養[23]。MCF7/TamR細胞由Zhu Tao博士提供。這些他莫昔芬抵抗細胞（TamR）是通過在含有5μM 4-羥基他莫昔芬（Sigma-Aldrich，美國密蘇里州圣路易斯）的培養基中培養親本細胞（WT）而獲得的。

miR-375表達上調并與ER⁺乳腺癌患者的不良預后相關

為了探討miR-375表達與乳腺癌預后之間的關系，我們首先使用KM-plotter數據庫基于miR-375表達水平分析了患者的總生存期。miR-375表達水平高的患者表現出明顯較差的總生存期，而表達水平低的患者則沒有這種預后差異（圖1A）。

討論

ER⁺乳腺癌占所有乳腺癌亞型的大約三分之二。廣泛的臨床和基礎研究已經證實，ERα是驅動絕大多數激素受體陽性乳腺癌發展的核心致癌因子。在乳腺癌細胞中，雌激素與ERα結合，強烈啟動一系列促進細胞增殖和抑制凋亡的遺傳程序，使其成為ER⁺乳腺癌的關鍵治療靶點[28]。

作者貢獻

D.X.和X.H.：撰寫——原始草稿、概念化、方法學設計。D.X.和X.C.：數據管理、撰寫——審閱和編輯。D.X.和J.S.：研究、數據管理。J.L.和Q.M.：數據管理。Y.X.和Y.H.：研究。Y.Y.和Q.L.：數據可視化。L.L.和G.M.：監督、資金獲取。所有作者都已閱讀并同意發表的手稿版本。

作者貢獻聲明

薛定龍：撰寫——原始草稿、研究、數據管理、概念化。 謝玉艷：研究。 孫佳月：研究、數據管理。 李家莊：數據管理。 黃亞茹：研究。 楊月：數據可視化。 梁龍旭：監督、資金獲取。 李琦：數據可視化。 穆關南：監督。 孟慶偉：數據管理。 陳學松：撰寫——審閱與編輯、數據管理。 黃曉儀：撰寫——原始草稿。

知情同意聲明

已從所有參與研究的受試者處獲得知情同意。

機構審查委員會聲明

本研究遵循赫爾辛基宣言進行，方案得到了哈爾濱醫科大學附屬醫院倫理委員會的批準（批準編號KY2021–15；2021年4月23日）。

資助

本工作得到了黑龍江省重點研究與發展計劃（2022ZX06C11）的支持。

利益沖突聲明

作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。

致謝

不適用。