神經絲輕鏈蛋白的暴露會通過p38/MK2/NF-κB/CREB1/Nrf2/HO-1信號通路促進蛋白質聚集、小膠質細胞增生、星形膠質細胞增生以及神經炎癥，進而引發帕金森病
《International Journal of Biological Macromolecules》：Neurofilament light chain protein exposure contributes to protein aggregation, microgliosis, astrogliosis and neuroinflammation via p38/MK2/NF-κB/CREB1/Nrf2/HO-1 signalling leading to Parkinson's disease
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NfL蛋白主動參與帕金森病進展，通過動物模型和AFM證實其聚集形態可誘導運動障礙、神經炎癥及氧化應激，并激活p38/MK2/NF-κB/CREB1通路，導致多巴胺能神經元損傷。
安朱曼·南達（Anjuman Nanda）、希瓦姆·庫馬爾·潘迪（Shivam Kumar Pandey）和拉凱什·庫馬爾·辛格（Rakesh Kumar Singh）
印度北方邦盧克瑙（Lucknow）薩拉吉尼納加爾（Sarojini Nagar）比杰努爾-西森迪路（Bijnour-sisendi Road）的拉埃巴雷利（Raebareli）國家制藥教育與研究學院（National Institute of Pharmaceutical Education and Research, NIPER）藥物學與毒理學系，郵編226002。
摘要
神經絲輕鏈（NfL）是一種公認的生物標志物，可用于檢測多種神經退行性疾�。òㄅ两鹕。≒D）中神經元結構的完整性。本研究通過將其效應與6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導的小鼠模型進行比較，探討了NfL蛋白如何主動促進PD的進展。我們使用原子力顯微鏡（AFM）觀察注射前NfL的聚集情況和纖維形態，并監測了注射后第0天、第14天和第28天動物的運動能力、協調性和認知能力。同時，我們評估了多種分子生化變化，包括促炎蛋白和凋亡蛋白的表達、多巴胺轉運蛋白（DAT）的表達、神經元核標記物（NeuN）以及膠質增生標記物（GFAP和IBA-1）的表達，以及酪氨酸羥化酶（TH）和α-突觸核蛋白（α-synuclein）的共定位，以評估手術第28天大腦紋狀體（striatum）和黑質致密部（SNpc）區域的多巴胺能病理特征。
NfL暴露導致動物運動能力顯著下降，出現類似焦慮的癥狀，并且認知行為減弱。我們發現TH水平顯著降低，同時α-突觸核蛋白積累增加。此外，這兩個區域的多巴胺轉運蛋白（DAT）和神經元核抗原（NeuN）表達也有所減少。NfL暴露還以劑量依賴的方式損害了氧化平衡，激活了促炎生物標志物并引發了膠質增生。
這項研究直接證明了NfL暴露及其體內聚集的病理作用，為理解NfL在動物體內誘導PD進展的機制提供了新的見解。
引言
帕金森�。≒D）的特點是多巴胺能神經元的逐漸喪失、異常的路易小體（Lewy bodies）在紋狀體和黑質致密部（SNpc）區域的積累以及神經炎癥[1]、[2]。慢性神經炎癥導致的神經元損傷會使多種神經元成分釋放到細胞外空間，如腦脊液（CSF）[3]和血液[4]中。腦脊液和血液中高水平的神經元特異性細胞骨架標志物（尤其是神經絲輕鏈（NfL）是臨床前[5]和臨床[7]、[8] PD模型中軸突損傷的可靠指標。因此，NfL可作為監測PD早期神經軸突退化的敏感標志物[9]、[10]、[11]。
NfL是一種特異存在于神經元中的中間絲，與微管和肌動蛋白一起構成神經元細胞骨架[12]。編碼NfL的NEFL基因發生轉基因突變會導致人類和動物出現多種疾病[13]、[14]，包括夏科-馬里-圖斯病（Charcot-Marie-Tooth disease, CMT）[15]、肌萎縮側索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）[16]和阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD）[17]，表明其在這些疾病進展中的關鍵作用。值得注意的是，NfL敲除（KO）小鼠在多種神經退行性疾病中表現出軸突直徑增大和運動缺陷減少[18]、[19]。NEFL基因還與ALS模型中的動物存活率提高及疾病發作延遲有關[20]。盡管經過數十年的研究，細胞外NfL釋放的機制及其對周圍神經膠質細胞的影響仍很大程度上未被探索。
NfL已成為軸突損傷的關鍵生物標志物，并與人類PD病情惡化直接相關，這表明細胞外NfL本身可能參與神經退行性過程。因此，我們假設NfL不僅僅是軸突損傷的被動指標，還可能主動參與神經退行性過程。在臨床前模型中，PD中的神經元損傷會通過鈣蛋白酶（calpain）驅動的酶促過程釋放出特定的NfL片段，從而激活小膠質細胞和巨噬細胞[21]。另有研究表明，腦室內注射6-羥基多巴胺（6-OHDA）會導致紋狀體區域NfL積累并伴隨運動障礙[22]。這提示直接外源性給予NfL也可能引發神經元變化，類似于已建立的6-OHDA模型，從而驗證了NfL作為PD主要病理介質的作用�；诖�，我們通過將外源性聚集的NfL肽注入動物大腦的紋狀體區域來評估各種神經炎癥和神經退行性事件。
細胞對壓力和炎癥的反應中，p38 MAPK通路起著關鍵作用[23]、[24]。其下游效應分子MAPK-激活的蛋白激酶2（MK2）[25]、核因子-κB（NF-κB）通路[26]、[27]和環腺苷酸反應元件結合蛋白1（CREB1）[28]、[29]在調節炎癥反應和神經保護中起著核心作用。p38 MAPK的激活或磷酸化在許多神經退行性疾病中會導致神經元死亡[30]，而細胞外NfL肽的存在可能會加劇這一過程。此外，NF-κB通路通過調控與炎癥、細胞存活和凋亡相關的基因，在NfL介導的神經毒性中起著關鍵作用[31]。CREB1在調節神經元存活、突觸可塑性和抗炎過程中也起著重要作用，但在PD中常常被失活[32]。p38/MK2/NF-κB/CREB1的異常激活與炎癥加劇、神經毒性和神經退行性變化有關。
本研究使用重組NfL肽作為主要誘導劑，探討其在PD中的病理作用。注射前我們通過原子力顯微鏡（AFM）確認了NfL的聚集形式。利用立體定向裝置將聚集的NfL通過紋狀體內注射方式注入動物的大腦特定區域。最新文獻顯示，轉基因PD模型中腦脊液中的NfL病理水平可能在200,000–600,000 pg/ml之間[33]、[34]。據此，我們選擇了兩種NfL蛋白劑量（0.8 ng/2 μl或400,000 pg/ml）和（8 ng/2 μl或4,000,000 pg/ml），以模擬動物大腦中NfL蛋白水平升高的病理情況[35]、[36]。
為了驗證NfL蛋白的致病潛力，我們使用了廣泛認可的6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導模型進行對比，因為該模型具有選擇性的多巴胺能神經退行性變化、運動缺陷和相關的神經炎癥。此外，我們還檢測了膠質增生標志物、緊密連接標志物、抗氧化蛋白以及p38/MK2/NF-κB/CREB1/Nrf2/HO-1通路，以了解其在PD病理中的潛在作用。本研究清楚地表明NfL如何主動促進神經炎癥級聯反應和神經退行性變化，從而導致動物PD的病理進展。這是首個在臨床前模型中證明單側給予NfL能有效再現PD關鍵病理特征的研究報告。
化學物質和試劑
重組人NfL蛋白（編號9715NF050）購自R&D Systems，并按照制造商的說明進行重組。對于紋狀體內注射，我們根據制造商的方案重新配制了重組NfL蛋白，并用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）稀釋得到最終注射濃度（分別為400,000 pg/ml和4,000,000 pg/ml），每2 μl中含有0.8 ng和8 ng的NfL。
重組NfL蛋白的特性及其在大腦區域的表達
我們使用原子力顯微鏡（AFM）分析了重組NfL蛋白的超微結構組織，通過Western blotting檢測了 sacrifice 后組織樣本中的NfL表達水平。二維地形圖（圖2A）和相應的三維表面重建顯示了云母表面存在有序的纖維結構。討論
盡管神經絲輕鏈（NfL）是PD中神經元損傷的公認生物標志物，但其對疾病發病機制的主動貢獻仍需進一步研究[56]、[57]。這是首項研究表明，在BALB/c小鼠中單側給予NfL能有效再現PD的關鍵病理特征，包括運動和非運動認知缺陷、神經元退化、異常蛋白質聚集、神經炎癥和氧化應激。
結論
總之，單側給予NfL會導致運動和非運動認知行為缺陷、由于神經元損傷導致的多巴胺能完整性受損、通過p38/MK2/NF-κB/CREB1通路引發強烈的炎癥信號傳導、炎癥細胞因子增加、氧化應激以及血腦屏障（BBB）完整性受損。這些發現強調了NfL在PD中的關鍵病理作用，表明針對NfL驅動的信號傳導機制可能具有治療潛力。
作者貢獻聲明
安朱曼·南達（Anjuman Nanda）： 數據可視化、驗證、方法學設計、實驗研究、數據分析。希瓦姆·庫馬爾·潘迪（Shivam Kumar Pandey）： 方法學設計、實驗研究、數據分析。拉凱什·庫馬爾·辛格（Rakesh Kumar Singh）： 文章撰寫與審稿、初稿撰寫、項目監督、軟件使用、資源管理、資金籌集、概念構思。
致謝
本研究的必要基礎設施和資金支持來自印度化學與化肥部（Ministry of Chemicals and Fertilizers）的制藥部門。作者感謝拉埃巴雷利國家制藥教育與研究學院（National Institute of Pharmaceutical Education and Research, Raebareli）的新藥輸送系統卓越中心以及印度化學與化肥部的制藥部門對本研究的財務支持。
