《ACS Chemical Neuroscience》：Fluorescence Detection of Alpha-Synuclein Aggregates in the Gut Using a Peptide Probe
編輯推薦：
本項研究開發了一種基于PSMα3肽序列的熒光成像探針P1，能夠特異性標記帕金森病(PD)相關的病理α-突觸核蛋白(α-syn)聚集體。該探針在細胞、PFF注射小鼠及轉基因小鼠的胃腸道(GI)組織中，展現出與磷酸化α-syn抗體(pS129)相當的標記準確性與特異性(PPV達87%)，并能有效檢測結腸黏膜表層的α-syn聚集體。P1具備成本低、染色快、特異性高等優勢，為通過內鏡活檢或篩查對PD風險進行早期分子診斷提供了有前景的新工具。
BODIPY630/650 作為優化的標記熒光團
研究團隊旨在開發一種能夠特異性標記病理α-突觸核蛋白(α-syn)聚集體的肽基熒光探針�；谙惹皥蟮赖年栯x子α-螺旋肽PSMα3對α-syn寡聚體和淀粉樣纖維具有高親和力的特性，研究人員首先嘗試使用中性電荷、低分子量、高量子產率的BODIPY-FL熒光團標記肽段，得到探針P0。然而，BODIPY-FL的綠色熒光通道易受組織自發熒光干擾，導致高背景。為避免此問題，研究轉向使用更長激發/發射波長的遠紅外染料。在嘗試了多種染料后，最終確定BODIPY630/650為最合適的熒光團，其背景信號低，游離染料在細胞中無染色，由此合成的BODIPY630/650標記肽被命名為探針P1。P1的合成快速、單步、高產率(90%)，便于放大生產，且其熒光和理化性質可通過修飾BODIPY基團進一步優化。
P1在原代海馬神經元中對α-syn聚集體展現高標記特異性
為驗證探針特異性，研究在體外模型中使用了從新生小鼠制備的原代海馬神經元，以模擬神經元環境。通過向神經元添加α-syn預制纖維(PFFs)誘導內源性α-syn形成路易體樣聚集體。結果發現，在未添加PFFs的對照細胞中，P1不標記α-syn單體；而在添加PFFs的細胞中，P1能夠特異性標記聚集的α-syn，并與作為金標準的磷酸化絲氨酸129 α-syn抗體(pS129)染色具有良好的共定位。經計算，P1的陽性預測值(PPV)平均為87.4%，漏檢率僅為8.7%，表明其對α-syn聚集體具有高特異性。
P1優先結合B*寡聚體和纖維，而非A*寡聚體和單體
為深入了解P1的標記性質，研究分析了其與不同α-syn物種（非毒性A*寡聚體、毒性B*寡聚體、PFFs和單體）的結合特性。光譜測量顯示，P1與B*寡聚體和PFFs結合時，其熒光激發和發射峰強度顯著增強，這可能是由于肽段結合到β-折疊疏水區域，限制了熒光團旋轉并屏蔽了水分子的非輻射猝滅所致。熒光滴定實驗測得P1與PFFs的結合解離常數(KD)為1.4 ± 0.26 μM。天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)和斑點印跡(Dot blot)結果均證實，P1能夠特異性地與毒性B*寡聚體和PFFs結合，而不與單體或非毒性A*寡聚體結合，且對人類和小鼠來源的α-syn聚集體均有效。
P1在PFF注射小鼠組織和PD患者死后腦組織中檢測α-syn聚集體，背景信號低
研究在PFF注射的野生型小鼠模型中評估了P1的離體組織染色效果。在腦內注射PFFs的小鼠海馬和皮層區域，觀察到了高水平的α-syn聚集，P1與pS129抗體均能特異性標記。相比之下，綠色熒光探針P0因與組織自發熒光重疊而難以區分，凸顯了使用遠紅外染料的重要性。在腸道注射PFFs的小鼠十二指腸組織中，僅觀察到低水平的α-syn聚集，這可能是由于所用小鼠相對年輕(4-6月齡)，α-syn病理成熟具有年齡依賴性。此外，在PD患者死后黑質腦組織切片中，P1能夠標記路易體(LB)和路易神經突(LN)，染色模式與pS129抗體相似，表明其對臨床樣本中的α-syn聚集體同樣具有高特異性。
P1在轉基因小鼠胃腸道中高亮α-syn聚集體的差異積累
為評估α-syn聚集在胃腸道組織內的分布，研究采用了兩種過表達α-syn的轉基因PD小鼠模型(JAX004479和JAX010799)。通過對食管、胃、十二指腸、空腸、回腸和結腸組織的全面分析，發現α-syn聚集在整個胃腸道均有分布，其中在食管和結腸中的染色強度最高。P1的染色與pS129抗體染色高度共定位(平均91.0%)，且在各組織中的陽性預測值(PPV)保持一致(平均87.8%)，證明其標記特異性不受不同胃腸道組織環境影響。高倍鏡下，在結腸組織的腸神經元中也能觀察到P1的標記。
α-syn聚集隨轉基因小鼠年齡增長而增加
比較年輕(5月齡)和年老(15月齡)的JAX010799轉基因小鼠發現，年老小鼠腦部和胃腸道組織中總α-syn水平以及高分子量α-syn物種均增加。免疫組化染色和圖像分析也一致顯示，年老小鼠食管和結腸組織中α-syn聚集的豐度更高。通過比較P1染色與總α-syn抗體染色的比值，以及pS129抗體與總α-syn抗體的比值，發現在所有胃腸道組織中，年老小鼠的α-syn聚集程度均更高，且兩種標記方法趨勢一致，表明肽探針P1作為診斷標志物的潛力可與pS129抗體相媲美。
α-syn聚集體在結腸黏膜中可被檢測
由于內鏡成像主要限于黏膜層，研究評估了結腸黏膜中α-syn聚集的豐度，以探討內鏡檢測的可行性。在轉基因小鼠展開的結腸組織中，α-syn聚集體在黏膜、黏膜下層和肌層均有分布，其中肌層聚集程度最高，但仍有超過20%的黏膜層α-syn被標記為聚集形式。這表明α-syn聚集是潛在的、可通過胃腸道進行PD篩查的生物標志物。為模擬臨床結腸鏡檢查中噴灑對比劑的過程，研究將P1快速灌洗到新鮮轉基因小鼠結腸的管腔內。結果顯示，P1能特異性標記深度約30 μm的表層黏膜中的α-syn聚集體，并與抗體染色共定位。這證明了P1在鏡檢應用中用于表層染色的實用性，但其穿透深度有限，能否成功應用于體內結腸鏡檢查，將很大程度上取決于表層黏膜是否存在足夠量的α-syn聚集體。
綜上所述，這項研究開發了一種肽基熒光探針P1，能夠在多種細胞和動物模型中特異性標記α-syn聚集體，其性能與磷酸化α-syn抗體相當。P1具有成本低、染色快速、特異性高等優勢，展現了作為診斷工具用于胃腸道組織活檢或常規內鏡篩查以評估帕金森病風險的前景。通過進一步的臨床驗證，P1有望為老年人群的帕金森病監測及患者分期提供新手段。
