《Biochemistry》：Cargo Recognition of Nesprin-2 by the Dynein Adapter Bicaudal D2 for a Nuclear Positioning Pathway That Is Important for Brain Development
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本研究綜述了Nesprin-2/BicD2復合物的結構與功能。該工作利用AlphaFold預測了Nesprin-2與動力蛋白接頭BicD2之間最小復合物的結構模型，并通過實驗驗證。該復合物的核心由Nesprin-2的血影蛋白重復（SR）與BicD2的C端貨物結合域（CTD）形成的α-螺旋束構成，與Rab6/BicD2和Nup358/BicD2復合物結構不同。研究發現，一個或兩個Nesprin-2分子結合BicD2二聚體均可激活動力蛋白（dynein）/動力蛋白激活蛋白（dynactin）/BicD2復合物進行持續的微管運動。BicD2/dynein結合位點與驅動蛋白-1（kinesin-1）結合位點（LEWD基序）空間上臨近但不重疊，暗示兩種馬達可同時結合Nesprin-2。研究還發現，導致Emery-Dreifuss肌營養不良癥（EDMD）的Nesprin-1/2突變位于馬達募集域，可能通過改變與動力蛋白和驅動蛋白-1的互作影響核定位，這闡明了該通路在腦和肌肉發育中的關鍵作用，并為相關發育疾病的機制提供了見解。
引言
Nesprin-2及其旁系同源物Nesprin-1是連接核骨架與細胞骨架（LINC）復合物的亞基，對大腦和肌肉發育至關重要。在神經元遷移過程中，Nesprin-2通過與驅動蛋白-1和動力蛋白互作來定位細胞核，其中動力蛋白由接頭蛋白Bicaudal D2（BicD2）募集，但這些相互作用的分子細節尚不清楚。此外，BicD2還參與其他對腦發育至關重要的運輸途徑，包括與核孔蛋白Nup358和Rab6GTP的互作。人類BicD2的疾病突變會導致嚴重的腦和肌肉發育缺陷，而Nesprin-1/2的突變則與Emery–Dreifuss肌營養不良癥（EDMD）相關，患者常出現細胞核異常聚集。因此，闡明Nesprin-2/BicD2復合物的結構基礎對于理解相關核定位通路的機制及其在發育疾病中的作用具有重要意義。
材料與方法
結構預測
使用ColabFold v1.5.5（其實現了AlphaFold）進行結構預測。預測了BicD2-CTD（人BicD2氨基酸715–804）與小鼠Nesprin-2（氨基酸6123–6421）以1:2和2:2化學計量比形成的異源二聚體結構模型。還預測了包含更大Nesprin-2片段（氨基酸5692–6342）和BicD2-CC3（氨基酸667–804）的復合物模型。使用UCSF ChimeraX制作結構圖，并通過PISA服務器識別接觸殘基。
GST下拉實驗
構建了N端GST標簽的小鼠Nesprin-2片段（氨基酸6123–6421）和N端his6標簽的人BicD2-CTD（氨基酸715–804）的表達載體。通過定點誘變獲得突變體。蛋白在大腸桿菌中表達并純化。將純化的BicD2-CTD與固定在谷胱甘肽柱上的GST-Nesprin-2片段孵育，洗滌后洗脫，通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析結合情況，并使用ImageJ對條帶強度進行定量。
圓二色光譜
對GST標簽的Nesprin-2片段（野生型和突變體）進行圓二色光譜分析。蛋白在10°C下使用Jasco J-1100光譜儀測量，波長范圍250-190 nm。使用BeStSel程序從CD光譜估算二級結構。
單分子結合與運動性實驗
從牛腦組織純化胞質動力蛋白、動力蛋白激活蛋白和微管蛋白。表達并純化全長人BicD2、小鼠驅動蛋白-1以及帶有不同標簽的Nesprin-2片段。對于單分子結合實驗，用不同熒光標記的鏈霉親和素標記蛋白，在玻片表面通過全內反射熒光顯微鏡觀察共定位。對于單分子運動性實驗，按特定摩爾比組裝動力蛋白/動力蛋白激活蛋白/BicD2/Nesprin-2（DDBN）復合物，用量子點標記BicD2或Nesprin-2。將復合物注入表面固定了微管的流道，記錄其運動軌跡，分析結合率、運動比例、速度和行程長度。
結果
通過AlphaFold獲得高置信度的最小Nesprin-2/BicD2復合物結構模型
通過尺寸排阻色譜耦合多角度光散射確定了最小Nesprin-2/BicD2復合物的化學計量比為2:2。使用AlphaFold預測了該最小復合物的結構模型。在模型中，Nesprin-2的SR52和SR53與BicD2-CTD形成一個α-螺旋束。預測對齊誤差圖顯示界面區域誤差主要低于5–10 ?，表明預測置信度高。局部距離差異測試分數在80-98之間，也表明模型可靠。包含Nesprin-2內在無序結構域（含有驅動蛋白-1募集位點LEWD基序）的區域不參與與BicD2的相互作用。此外，還預測了1:2化學計量比的復合物結構，其與2:2復合物結構高度相似。研究還證實了旁系同源物Nesprin-1的相應結構域也能與BicD2-CTD直接相互作用，其預測的結構模型與Nesprin-2復合物相似。
Nesprin-2/BicD2-CTD復合物結構模型的驗證
通過構建一系列Nesprin-2缺失體并進行GST下拉實驗驗證結構模型。缺失整個內在無序結構域（含LEWD基序）的Nesprin-2最小片段（氨基酸6123–6340）仍能強效結合BicD2-CTD，證實該域對結合是非必需的。而缺失SR52和SR53的構建體則無法下拉BicD2-CTD。進一步，根據結構模型對Nesprin-2和BicD2的接觸殘基進行丙氨酸突變。下拉實驗鑒定出BicD2的五個突變體和Nesprin-2的五個突變體能顯著降低結合。其中，設計了一個破壞Nesprin-2與BicD2之間關鍵疏水接觸的三重突變體（V6246A/L6253A/F6261A），該突變體幾乎完全廢除了相互作用。圓二色光譜分析表明，這些降低結合的Nesprin-2突變體的二級結構與野生型相似，說明突變并未導致蛋白錯誤折疊或大的結構變化，從而驗證了這些殘基是真正的接觸殘基。
三種對腦發育重要的BicD2/貨物復合物結構模型比較
將新建立的Nesprin-2/BicD2復合物模型與此前已驗證的Nup358/BicD2和Rab6GTP/BicD2復合物模型進行比較。三者結構截然不同：Nesprin-2通過其SR與BicD2形成螺旋束；Nup358通過一個貨物識別α螺旋結合在BicD2-CTD中部，該螺旋在游離狀態是無序的；而Rab6GTP則結合在BicD2-CTD的極端C端區域。Nesprin-2和Nup358的BicD2結合位點之后都有一段內在無序連接區和一個LEWD基序（驅動蛋白-1結合位點），但Nesprin-2的連接區更長（約65個殘基對約30個殘基）。Rab6則缺乏已知的驅動蛋白-1募集位點。這些結構差異可能微調所募集動力蛋白和驅動蛋白-1的整體運動性。
Nesprin-2片段與全長BicD2及全長驅動蛋白-1結合
單分子結合實驗顯示，包含LEWD基序的較大Nesprin-2片段（氨基酸6123–6421）與全長驅動蛋白-1存在強相互作用。而不含LEWD基序的片段與驅動蛋白-1的結合僅為背景水平。同時，不含LEWD基序的最小Nesprin-2片段（氨基酸6123–6352）與全長BicD2存在強相互作用，而破壞BicD2結合的三重突變體則顯著削弱了這種結合。
一個Nesprin-2分子即可激活動力蛋白/動力蛋白激活蛋白/BicD2復合物進行持續運動
單分子運動性實驗表明，Nesprin-2片段能夠解除BicD2的自抑制，從而激活動力蛋白/動力蛋白激活蛋白/BicD2（DDBN）復合物進行持續的微管運動。與自抑制的DDB復合物相比，DDBN復合物與微管的結合率更高，發生持續運動的比例更高，并表現出可測量的速度和行程長度，但其激活水平低于組成型活性片段BicD2CC1形成的DDBCC1復合物。該結果證實無需其他組分即可激活此運輸通路。通過使用紅色和綠色量子點分別標記Nesprin-2片段，發現約22%的DDBN復合物結合了兩個Nesprin-2分子，78%的復合物只結合了一個Nesprin-2分子。重要的是，結合一個或兩個Nesprin-2分子的DDBN復合物，其運動速度和行程長度沒有統計學差異，表明一個Nesprin-2分子足以激活BicD2介導的動力蛋白運動。
討論
本研究提出了一個經過實驗驗證的最小Nesprin-2/BicD2復合物結構模型，其核心是Nesprin-2的SR與BicD2-CTD形成的α-螺旋束。一個或兩個Nesprin-2片段可預測性地結合到BicD2二聚體的對稱結合位點上。包含驅動蛋白-1募集位點LEWD基序的內在無序結構域對BicD2結合是非必需的，這表明驅動蛋白-1和BicD2/動力蛋白有可能同時與Nesprin-2相互作用。最小Nesprin-2片段能與全長BicD2結合，并強效激活BicD2/動力蛋白/動力蛋白激活蛋白復合物進行持續運動，且結合一個或兩個Nesprin-2分子所產生的運動特性相似。Nesprin-2/BicD2相互作用在結構上不同于其他BicD2/貨物復合物，這種差異可能微調相關運輸通路的整體運動性。
Nesprin-2的細胞質結構域可能受F-肌動蛋白結合等因素調節其寡聚狀態，而單一或雙重Nesprin-2分子均可激活BicD2的特性，可能使得動力蛋白的運動性獨立于細胞中Nesprin-2的寡聚狀態。有研究表明SR48能增強BicD2與Nesprin-2的親和力，但包含SR52-SR56的馬達募集結構域（不含SR48）的迷你Nesprin-2已能在體內恢復正常的神經元遷移，且本研究中僅含SR52和SR53的最小片段在體外能強效激活動力蛋白復合物，因此SR48對馬達募集和通路激活并非必需。
導致腦和肌肉發育疾病的BicD2突變對其與不同貨物（Nesprin-2、Nup358、Rab6）的親和力有差異化影響，從而調控相關細胞運輸通路。這與此前三種BicD2/貨物復合物結構模型揭示的結合位點重疊但不同的結論一致。此外，數個人類EDMD致病突變位于Nesprin-1/2的馬達募集結構域內，可能通過改變與BicD2和驅動蛋白-1的相互作用，影響動力蛋白和驅動蛋白-1介導的肌核定位，從而導致患者出現異常聚集的細胞核。Nesprin-2和BicD2的多個磷酸化位點可能為此通路的時空調控提供了機制。
結論
本研究建立并驗證了最小Nesprin-2/BicD2復合物的結構模型。復合物核心由Nesprin-2的血影蛋白重復與BicD2形成的螺旋束構成，該結構不同于其他已知的BicD2/貨物復合物。結構上的差異可能調節相關運輸通路的整體運動性。BicD2/動力蛋白結合位點與驅動蛋白-1結合位點在空間上臨近但不重疊。研究發現，募集一個或兩個Nesprin-2片段至BicD2/動力蛋白/動力蛋白激活蛋白復合物，均可強效激活其進行持續運動，且速度和行程長度相似，表明此運輸通路無需其他額外組分。研究還設計了一個能破壞BicD2與Nesprin-2相互作用的三重突變體，這將為研究該核定位通路在腦發育中的作用提供有價值的工具。數個EDMD致病突變位于Nesprin-1/2的馬達募集結構域，可能改變其與BicD2和驅動蛋白-1的相互作用，這與EDMD患者細胞核異常聚集的現象相符。本研究結果將指導未來深入探索Nesprin-1/2在腦和肌肉發育中的關鍵作用，并揭示由Nesprin-1/2和BicD2突變（如EDMD和脊髓性肌萎縮癥）引起的嚴重發育疾病的潛在機制。
