生物通報(bào)道：多年來(lái)，跟蹤一個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，超出了我們的能力。但是現(xiàn)在，時(shí)代已經(jīng)變了，新的單細(xì)胞RNA-seq方法，可以分析大量的細(xì)胞及它們的命運(yùn)。

我們都參加過(guò)大型生日派對(duì)：在擁擠的房間里，與許多人聊天、吃飯和慶祝。但是，試想你并不知道壽星是誰(shuí)，只是像一個(gè)局外者看待這個(gè)派對(duì)。你可能會(huì)覺(jué)得整個(gè)事件看起來(lái)與其他的生日派對(duì)沒(méi)有什么不同。然而，派對(duì)上的每個(gè)人都在壽星的生活故事里擔(dān)當(dāng)獨(dú)特的角色。所以，如果不知道每位來(lái)賓和他們的角色，一個(gè)局外人可能就會(huì)做出錯(cuò)誤的假設(shè)，或錯(cuò)認(rèn)聚會(huì)上的人。

復(fù)雜器官的細(xì)胞成分，有點(diǎn)類似于生日派對(duì)。細(xì)胞群體在特定的時(shí)刻聚在一起，執(zhí)行關(guān)鍵的功能，形成一種器官。細(xì)胞亞群以不同的方式起作用，在特定的時(shí)間點(diǎn)履行專門的職責(zé)。（如同在聚會(huì)上，不同的人帶來(lái)禮物、吃食或幫助安排活動(dòng)）。從技術(shù)的角度來(lái)看，仔細(xì)分析這些細(xì)胞如何單獨(dú)起作用，制造一個(gè)器官，為研究人員帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。但是，隨著科學(xué)家們不斷設(shè)計(jì)出的巧妙新技術(shù)，梳理每個(gè)細(xì)胞在許多復(fù)雜過(guò)程中所起的作用，這些挑戰(zhàn)都會(huì)逐漸消失。

一系列事件
當(dāng)進(jìn)入一個(gè)生日聚會(huì)時(shí)，大多數(shù)人所做的第一件事情就是，簡(jiǎn)單的觀察，跟來(lái)賓交談。他們是誰(shuí)？他們做什么？他們來(lái)自哪里？他們認(rèn)識(shí)壽星多久了？

在解決“單個(gè)細(xì)胞如何在復(fù)雜系統(tǒng)中起作用”的過(guò)程中，科學(xué)家采取了相似的路徑。他們選擇單個(gè)細(xì)胞并孤立地研究它們。然而，分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分子分析，非常棘手，而接下來(lái)的問(wèn)題是，一旦分離出它們之后，如何研究它們？那就是，測(cè)定特定時(shí)刻每個(gè)細(xì)胞正在制造的RNA轉(zhuǎn)錄本，對(duì)正在發(fā)生的事情獲得一個(gè)快照。有了足夠多的快照，就有可能漸漸弄清復(fù)雜的細(xì)胞事件和不同生物學(xué)過(guò)程所需的時(shí)間。

單細(xì)胞RNA測(cè)序（RNA-seq），是從2008年高通量測(cè)序變革陰影中出現(xiàn)的新一代測(cè)序（NGS）應(yīng)用，當(dāng)時(shí)有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了測(cè)定生物學(xué)樣本RNA含量的不同方法。在過(guò)去的六年中，RNA-seq已經(jīng)給我們展示了RNA世界的驚人多樣性，從我們已經(jīng)知道的轉(zhuǎn)錄合成蛋白質(zhì)的mRNA，到在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA。相關(guān)閱讀：利用RNA-seq研究非模式生物。

早期的RNA-seq研究主要集中在細(xì)胞群體，在細(xì)胞周期不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞混合物，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，以確定正在表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄本。而這些轉(zhuǎn)錄譜能提供已知的和新的RNA目錄，這一信息可告訴你參加聚會(huì)的賓客名單。這是一個(gè)很好的開(kāi)始，但沒(méi)有提供你可能會(huì)喜歡的詳盡細(xì)節(jié)。

時(shí)間就是一切
哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的再生生物學(xué)和干細(xì)胞助理教授John Rinn，致力于探索RNA世界。他已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些新的功能性非編碼RNA（ncRNA），ncRNA一度被認(rèn)為是跟轉(zhuǎn)錄噪聲差不多的分子。

長(zhǎng)非編碼RNA（LncRNA，例如XIST）是一類專門的RNA，其生物學(xué)作用最近才開(kāi)始為人所了解。Rinn稱：“我們可以利用單細(xì)胞測(cè)序，進(jìn)一步了解XIST的功能。”

在2012年，Rinn的研究小組開(kāi)始尋找更多功能形式的長(zhǎng)非編碼RNA，特別尋找充當(dāng)強(qiáng)大細(xì)胞調(diào)控因子的RNA。為此，他和同事們應(yīng)用單細(xì)胞RNA-seq，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞分化這類過(guò)程中基因轉(zhuǎn)錄的pseudotemporal動(dòng)力學(xué)。通過(guò)編目所有的細(xì)胞RNA，連同它們?cè)诩?xì)胞中的出現(xiàn)和消失時(shí)間，Rinn希望找到一些有趣的新lncRNA，他能夠?qū)⑻囟ǖ墓δ軞w因于這些新lncRNA。但是，很奇怪的事情發(fā)生了：他發(fā)現(xiàn)了無(wú)聊的舊mRNA。

Rinn將這些結(jié)果發(fā)表在今年3月份的《Nature Biotechnology》雜志，介紹了肌細(xì)胞生成的6種新細(xì)胞調(diào)控因子，他解釋說(shuō)：“細(xì)胞沒(méi)有定義明確的mRNA表達(dá)模式，它不像‘現(xiàn)在打開(kāi)’和‘關(guān)閉’那么簡(jiǎn)單。”然而，對(duì)Rinn來(lái)說(shuō)最大的驚喜可能就是，他在數(shù)據(jù)中觀察到了基因表達(dá)的隨機(jī)性，相當(dāng)于在生日聚會(huì)上不斷來(lái)去的人們，每一分鐘都在改變著房間的動(dòng)態(tài)。你如何捕捉所有這些變化并分析這些數(shù)據(jù)呢？

隨機(jī)性總是為生物學(xué)家?guī)��?lái)挑戰(zhàn)。在這種情況下，在單個(gè)細(xì)胞之間基因表達(dá)數(shù)據(jù)顯示出非常高程度的可變性。生物學(xué)變化不是唯一的問(wèn)題——Rinn也需要考慮測(cè)序文庫(kù)制備過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)可變性。但是可變性也提出了可能性。

Rinn指出：“實(shí)際上，可變性和多樣性會(huì)告訴你調(diào)控因子在哪里。”想象一個(gè)調(diào)控因子不受可變性的影響——這會(huì)產(chǎn)生更多的數(shù)據(jù)可信性。他們的解決方案是，開(kāi)發(fā)一種無(wú)人監(jiān)督的聚類算法，稱為Monocle，能夠提高單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)的時(shí)間分辨率，并處理基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的變化。利用Monocle的分類方法，Rinn能夠找到六種新的肌細(xì)胞生成調(diào)控因子，同時(shí)解釋數(shù)據(jù)集中的實(shí)驗(yàn)和生物學(xué)變化。

諸如Monocle的程序的出現(xiàn)，最終會(huì)為研究人員提供一種途徑，以一種有意義的方式，檢測(cè)生物學(xué)過(guò)程的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)，使他們能理解來(lái)自RNA-seq轉(zhuǎn)錄本目錄的所有數(shù)據(jù)，較全面地了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。

準(zhǔn)備一個(gè)大型聚會(huì)
當(dāng)研究很少數(shù)的細(xì)胞時(shí)，用今天的測(cè)序技術(shù)和分析平臺(tái)，去確定在轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)早期或晚期階段中正在打開(kāi)的是什么，是一個(gè)相當(dāng)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)。但是，怎樣處理較大數(shù)量的細(xì)胞，獲得更詳細(xì)的信息呢？

通過(guò)在小型生日聚會(huì)上與別人交談，可以了解更多關(guān)于壽星的事情。然而，這不難看出，隨著聚會(huì)越來(lái)越大，很難發(fā)現(xiàn)那些相同的模式、趨勢(shì)和信息。如果你只跟一小部分的客人交談，如果偶然他們告訴我們關(guān)于壽星的完全不同的故事、給我們的信息太少，以至于不能建立聯(lián)系并得出結(jié)論，會(huì)發(fā)生什么情況？顯而易見(jiàn)的答案是，我們需要跟更多的人交談。在單細(xì)胞分析中同樣如此。

Rinn說(shuō)：“用200個(gè)細(xì)胞，你開(kāi)始了解情況。但是原則上，你采用的細(xì)胞越多，分辨率就越高。”分析幾百個(gè)單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)，即使用今天的測(cè)序系統(tǒng)，工作量也很大，這還不考慮數(shù)據(jù)分析在內(nèi)。

魏茨曼研究所免疫系的Ido Amit面臨著這種情況。測(cè)定有限數(shù)量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，特別是那些已經(jīng)用特殊細(xì)胞標(biāo)記分離出來(lái)的細(xì)胞，因此，這對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程和每個(gè)細(xì)胞所起的作用，只能提供有限的認(rèn)識(shí)。此外，需要公正的信息來(lái)了解從每個(gè)分析的細(xì)胞所獲得的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄譜。

為了解決這個(gè)通量限制，產(chǎn)生較高容量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，Amit及其同事開(kāi)發(fā)出一種大規(guī)模并行RNA-seq工作流程，能夠同時(shí)破譯數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)轉(zhuǎn)錄組，而不需要特定的標(biāo)記，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在今年4月份的《Science》雜志。這一工作流程的關(guān)鍵是，能夠收集單細(xì)胞樣本，然后barcode和多重RNA-seq反應(yīng)。

最初，通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選（FACS）將單個(gè)細(xì)胞分類到384孔板中。然后，利用標(biāo)記的材料和三個(gè)級(jí)別的barcoding，集中處理細(xì)胞。Amit研究小組利用該工作流程，能夠測(cè)定4000多個(gè)小鼠脾臟的單細(xì)胞RNA，這些細(xì)胞被濃縮用于表達(dá)CD11c表面標(biāo)記。多路復(fù)用實(shí)驗(yàn)可讓1536個(gè)細(xì)胞在一個(gè)單軌道進(jìn)行測(cè)序，在來(lái)自每個(gè)細(xì)胞的200和1500種不同RNA分子之間，產(chǎn)生22000個(gè)對(duì)齊的讀長(zhǎng)（reads）。類似于Rinn的發(fā)現(xiàn)，Amit的數(shù)據(jù)也顯示大量基因的高度細(xì)胞變異，這明確表明，檢測(cè)的脾臟細(xì)胞群具有異質(zhì)性，并且有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控因子和通路。

近年來(lái)，RNA-seq方法和分析工具有了很大的提高，這使得單細(xì)胞分析不僅能表明變異存在，也為研究人員提供了一種方法，來(lái)了解這一轉(zhuǎn)錄變異背后的生物學(xué)意義。

（生物通：王英）

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