有了熒光，生物世界開始變得很美妙。由于只需物理方法（光照）即可檢測，無需涉及化學反應，亦無同位素的危險，熒光技術早已成為研究生物微觀世界中最方便、最重要的示蹤工具之一。生物通11月聚焦絢麗多彩的熒光染料，為大家介紹常用的核酸染料、蛋白染料、細胞器染料以及熒光蛋白。在此之前，我們有必要先了解一些熒光的基本知識。

熒光激發三部曲

能夠發出熒光并能作為染料的化合物稱為熒光基團或熒光染料。有的熒光基團本身不發光，可卻能特異高效地結合某類生物大分子，并在結合后發出美麗的熒光，比如核酸染料；有的熒光基團本身可以在一定條件下發出熒光，我們需要將這個“明燈”以特殊的方法“掛”在某些可“指路”的生物大分子上，使這大分子變成“指路燈”，可用于定位生物標本中的特定區域或者示蹤，這時我們通常稱之為熒光探針。

除了熒光染料，還有一類蛋白質能被激發出各種顏色的美麗熒光，常用于蛋白表達標簽而作為示蹤或者定量的工具，如大名鼎鼎的綠色熒光蛋白就是其中之一，這個生物通將在后續的文章中另作介紹。
美麗的熒光從哪里來？請看圖1的三部曲。
 

圖1. 熒光激發過程的示意圖。（摘自Molecular Probes: The Handbook）

第1階段：激發
激發光源如白熾燈或激光提供了光子能量hνEX。熒光基團吸收能量后，到達單重激發態(S1')。此過程就將熒光和化學發光區別開來，因為后者的激發態是由化學反應引起的。

第2階段：激發態的壽命
激發態的壽命很短暫，通常只有1到10納秒。在這段時間內，熒光基團經歷了構象的改變，并與它所處的分子環境發生了大量的相互作用。此過程有兩個重要的結果：第一，S1'的能量部分損失，使熒光基團到達能量略低的S1單重激發態。第二，并不是所有被激發的分子最終都通過熒光發射回到基態（S0）。碰撞淬滅、熒光共振能量轉移（FRET）等過程也會使S1減少。

第3階段：熒光發射
在這一階段，熒光基團釋放出光子能量hνEM，回到基態S0。由于能量損耗，光子的能量減少，發射波長總是大于其激發波長，兩者之間的差值叫斯托克斯位移（Stokes shift）。在熒光分析中，就是利用斯托克斯位移現象，將激發光與熒光物質的發射光分離開來，只檢測發射光，從而提高檢測的靈敏度和選擇性。有些熒光色素的斯托克斯位移較大，而有些熒光色素的斯托克斯位移較小。斯托克斯位移越大，其激發光譜和發射光譜的重疊就越少，有利于提高其分辨率。

熒光光譜

在我們選擇熒光染料時，熒光光譜是不可不看的，激發波長和檢測波長等重要信息都蘊含其中。激發光譜是通過測量熒光物質的熒光發射強度隨激發波長變化而獲得的光譜；而發射光譜是在固定激發波長下掃描發射單色器所測得的光譜。在熒光分析中，可利用激發光譜選擇靈敏的激發光波長，利用發射光譜選擇靈敏的檢測波長。

在激發光譜上可以看到在某一激發波長下，該熒光染料具有最大的發射熒光強度，則該激發光波長稱為最大激發波長λex。在發射光譜上，最大發射熒光強度所對應的波長稱為最大發射波長λem。通常會將一種染料的激發光譜和發射光譜放在同一張圖上，如圖2所示。這是Hoechst 33342與DNA結合后的光譜圖，它的最大激發波長為350 nm，最大發射波長為461 nm，中間的差值即為斯托克斯位移。測定熒光時，激發波長在λex、發射波長在λem的檢測靈敏度最高。
 

圖2. Hoechst 33342與DNA結合后的熒光光譜。

熒光儀器

要想看到絢麗的熒光，除了熒光染料，檢測系統也是必不可少的。熒光檢測儀器有幾個基本要素：1) 激發光源，2) 將發射光子與激發光子分開的濾光片，3) 記錄所產生的電信號或圖像的探測器。我們經常使用的儀器主要有4種類型，每一種都提供了完全不同的信息：

• 熒光分光光度計和微孔板讀數儀主要測量大量樣品（微升到毫升）的平均性質。
• 熒光顯微鏡在二維或三維的空間座標中解析微小物體（直徑小于0.1 mm）的熒光。
• 熒光掃描儀，包括芯片掃描儀，在二維的空間座標中解析大物體（如電泳膠、印跡和層析圖）的熒光。
• 流式細胞儀測量流動束中每個細胞的熒光，鑒定并定量大樣品中的亞群。

其他類型的儀器也能進行熒光檢測，如毛細管電泳裝置、DNA測序儀和微流體設備。每種儀器對熒光探針的要求都不盡相同。比如，對熒光顯微鏡而言，光漂白是一個大問題，但是對于流式細胞儀來說，這不算什么，因為光源照射細胞的時間很短暫。

如何選擇熒光染料

現在市場上的熒光染料也是越來越多，光是著名的Molecular Probes（03年被Invitrogen收購），目錄就是厚厚一本，相同用途的染料也分好多類，真是眼花繚亂，不知該如何下手。其實也不必這么糾結，搞清楚以下幾點就行了。首先，你的用途是什么；其次，了解儀器的特性-激發波長和濾光片，然后再結合光譜圖來選擇合適的染料。如果還是有多個選擇，那么可以比較一下它們的量子產率、光穩定性、pH穩定性等等。一般說來，熒光基團的量子產率要在0.35以上，才能用于熒光分析。另外還要注意染料的通透性，特別是細胞器染料，會分為活細胞和死細胞兩種，一定要看清楚了。

生物通小貼士：初次使用的人士還是多看看文獻吧，一來可以導購，二來可作為實驗的參考。熒光染料這種化學物質，它的說明書一般都不會很詳細，只是泛泛地列出了使用的濃度范圍，你千萬別指望有質粒抽提試劑盒那樣的protocol。小編曾經就這個問題問過相關的技術人員，他的回答是，這東西就像醬油，只能告訴你做菜加一點，具體是加5滴還是一勺，那只能是自己摸索。

多色標記

當多重分析成為一種潮流，更多的實驗也開始引入兩種或以上的探針，來同時監測不同的生化功能。這種多色標記技術主要應用于流式細胞儀、DNA測序、熒光原位雜交和細胞器標記中。在選擇同時使用的幾種熒光探針時，必須注意熒光染料的發射光譜需要足夠分開，才能有利于信號分離和數據分析。一般選擇發射光譜沒有交叉或交叉小，發射峰值波長不同，熒光發射強度相當，在儀器上各熒光信號彼此能夠分開的熒光探針標記樣品。因此，那些光譜帶寬窄的染料更受歡迎，比如Molecular Probes的Alexa Fluor系列。當然，最理想的組合是那些激發波長一致，而發射波長相去甚遠的染料。但理想歸理想，這樣的組合往往不多見。

光漂白

提高激發光的強度可以提高熒光的強度，但是，激發光的強度不是可以無限提高的。因為激發光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發態分子，這就是光漂白的現象。對于熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡而言，光源需長時間照射樣品，光漂白現象就可能嚴重影響測量。

解決光漂白問題的最有效辦法是增強檢測靈敏度，這樣就能降低激發光的強度。使用CCD照相機等低亮度的檢測裝置，以及高數值孔徑物鏡和最寬帶通的濾光片，都能增強檢測靈敏度。當然，最好是選擇一些光穩定性更好的染料，例如Alexa Fluor 488染料就比FITC要強得多。另外，你也可以使用抗淬滅劑。目前市場上用得較多的是Molecular Probes的SlowFade和ProLong試劑，它們可以降低光漂白，不過不能用于活細胞。但需要注意的是，這些方法只是僅供參考，是否奏效還很難說，因為在某種程度上，光漂白速率還取決于熒光基團所處的環境。

本文只是對熒光染料的最基本知識作了簡單介紹，屬于掃盲班類別，如果你想更深入地了解它們，建議你向Invitrogen索取大部頭的《Molecular Probes: The Handbook》或一些中文版的書籍。后面我們將會介紹常用的核酸染料、蛋白染料、細胞器染料和熒光蛋白，敬請期待……

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