幾十年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）及相關的blot已經成為蛋白分析的主流技術。考馬斯藍染色和銀染也就成了我們最熟悉的染色方法。不過，隨著蛋白質組學的發展，定量蛋白質組和多重分析越來越流行，這些染料已經無法滿足更高的要求。此時，熒光染料的優勢就凸顯出來。生物通這就帶大家看看市場上主流的蛋白熒光染料，包括總蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。另外，本文還會介紹一些特殊用途的熒光染料。

總蛋白染料

與傳統的考馬斯藍染色相比，熒光染色可將檢測的靈敏度降至1 ng以下，與銀染相當；而與銀染相比，熒光蛋白染料的線性范圍比銀染寬很多，一般可達3個數量級以上，且對不同種蛋白的染色強度變化小，與蛋白質量成清晰的線性關系，而不依賴于多肽序列及糖基化程度。目前的熒光染色法與后續的質譜分析和Edman測序等技術兼容，因此無論在1D還是2D電泳領域都日漸受到研究人員的青睞。蛋白熒光染料需要一個紫外光透射儀（下紫外）才能觀察，當然，有激光掃描儀時效果更佳。

名氣最大的總蛋白熒光染料當屬Invitrogen旗下Molecular Probes公司持有專利的SYPRO® 熒光蛋白染料系列。這一最早上市的熒光蛋白染料系列包括了SYPRO® Ruby，SYPRO® Red，SYPRO® Tangerine幾種不同顏色。其中紫紅色的SYPRO® Ruby最為著名，也有人翻譯成SYPRO紅寶石。它的檢測極限為0.25-1 ng，線性范圍超過3個數量級。它與堿性氨基酸和多肽主鏈結合，因此不同蛋白之間的差異性小，可進行更為準確的定量。它的染色范圍包括糖蛋白、磷酸化蛋白、脂蛋白、鈣結合蛋白及其它難染色的蛋白，不會過度染色，也不干擾后續的質譜分析和Edman測序等技術。操作起來也很簡單，固定兩次，染色過夜，脫色就OK了。如果你想快一點看到結果，可以用微波爐來快速染色，時間只需要1個半小時。SYPRO Ruby是即用型的1×染料，使用方便，當然價格也不便宜。SYPRO Ruby有兩個激發峰-280 nm和450 nm，發射峰為～610 nm。紫外透射儀、藍光透射儀或激光掃描儀都可以觀察染色后的蛋白。

簡單而快速的SYPRO Red和SYPRO Tangerine通常用于1D電泳的凝膠染色。產品如其名，一種是鮮艷的正紅色，一種是明亮的金橘色。以Lonza公司（即原來FMC王牌瓊脂糖的電泳系列，賣給Cambrex后又被合并到Lonza旗下）的產品為例，取適量5000x濃度的原液稀釋為1x濃度，遮光浸泡凝膠40-60分鐘后即可上紫外透照儀，CCD或者激光掃描儀進行檢測，無需額外的固定步驟，檢測下限可低至每條帶1ng蛋白。稀釋液在遮光4°條件下可以穩定保存至少3個月。SYPRO Tangerine尤為值得推薦。這種熒光蛋白染料在整個使用過程中無須用到酸或者有機溶劑，染色可在saline或者PBS或Tris-HCL等多個體系的緩沖液中進行，不與蛋白共價結合也不影響抗體結合，無需洗脫即可直接轉膜進行Western Blotting，兼容后繼的酶法分析或者Western Blotting，特別適用于非變性膠的活性蛋白檢測。SYPRO Red則需要用乙酸溶液稀釋。這兩種染料在長時間UV光照下會發生光漂白，這時只要重新染色即可。這兩種染料價格差不多，500ul的5000x原液價格在2000多人民幣。

Bio-Rad公司的總蛋白染料有個很好聽的名字，火烈鳥-Flamingo Fluorescent Gel Stain。它的線性范圍也超過3個數量級，靈敏度似乎比SYPRO Ruby更高，在激光掃描模式下它的檢測極限能達到30 pg。染色所需時間為5小時，且著色深淺對染色時間不敏感，無需脫色。Bio-Rad沒有提供快速染色的protocol，雖然手工操作的時間很少，但5小時還是略嫌稍長。染過的凝膠在2-8℃下可保存6個月而無明顯褪色。Flamingo染料的最大激發峰和發射峰分別為512 nm和535 nm，不過在271 nm有第二激發峰，也可用紫外光激發。

Pierce（現屬于賽默飛世爾科技）的Krypton Protein Stain 名字雖不起眼，也是市場上很受歡迎的一款蛋白染料。就檢測靈敏度和線性范圍而言，它與前兩款不分伯仲。它的一個明顯優勢就是染色時間較短，雖說步驟有些繁瑣，但整個過程只需要2小時40分鐘。另外，它也提供了快速染色的步驟，只要半個小時就能看到結果了，當然，時間快了靈敏度也會打折扣。Krypton Protein Stain的性價比很高，在這三種熒光染料中，它是最便宜的。它與Flamingo都是10×的濃縮液，使用前需要用水稀釋。

另外，PIERCE還專門為紅外激光成像開發了一款總蛋白染料Krypton Infrared Protein Stain。它的靈敏度、檢測時間都與Krypton Protein Stain相似，不過激發和發射波長更大，在690和718 nm，適合于LI-COR的Odyssey及其它紅外成像系統。

三款主流總蛋白熒光染料的參數對比

* 還有其他規格，請向當地經銷商或廠家咨詢。

除了最常見的凝膠染色，SYPRO® Ruby還可用于等電聚焦IEF，且只需進行一次20分鐘的固定（1D不用固定，但等電點聚焦IEF則需要固定3小時），染色3個小時（IEF需要染過夜），脫色30分鐘后即可觀察。Lonza這個產品1L的即用型原液價格要3000左右。值得注意的是SYPRO® Ruby在整個使用過程都要遮光，且應用聚丙烯類塑料盤染色，避免使用玻璃。SYPRO® Ruby染色結果經過2%甘油浸泡后可以進行干膠永久保存，只是極低濃度的條帶就可能看不到了。另外還有個小秘密，Lonza的說明書里提及由于甲醇和乙酸混合可能產生乙酸乙酯，對后繼的質譜可能有影響，后面考慮做質譜的同學或許需要考慮用其他替代。

另外，Invitrogen還有一種SYPRO Ruby protein blot stain，是專門染膜的，作用就像麗春紅。但它的優點是不與蛋白共價結合，也就不影響后續的鑒定過程，因此可用于免疫染色之前，來定位分子量標準或看看樣品的總蛋白圖譜，這樣就免去了平行跑兩塊膠的麻煩，輕松比較總蛋白和目的蛋白。它還與后續的測序和質譜分析兼容。只需染色15分鐘，SYPRO Ruby protein blot stain就能檢測PVDF或NC膜上的2-8 ng/條帶。膜染料還有一種，名字也相當好聽，SYPRO Rose Plus Protein Blot Stain，靈敏度與Ruby不相上下，不過染色是可逆的。通過膜的洗滌，染料很容易就被完全剝離，這就很適合于臨時的檢測，比如蛋白芯片中的質量控制。這兩個膜染料的價位都在兩千出頭，可用于1600 cm²的印跡膜。

2D DIGE

說到熒光，又談到2D，那怎么能忘了正流行的2D DIGE呢。熒光差異凝膠電泳技術是在傳統雙向電泳技術的基礎上結合了多重熒光分析的方法，可在同一塊膠上同時分離多個分別由不同熒光標記的樣品。由于不同的熒光標記樣品有不同的激發波長，可通過不同的濾光片記錄互不干擾的膠圖結果。由于有了多色熒光標記，使得在同一塊膠中分離并分析多個樣本成為可能。這樣有效避免了不同膠間的系統誤差，特別適合比較不同樣本間差異。

熒光染料種類雖多，但用于蛋白質組樣品標記的熒光染料不同于普通熒光染料，標記后的蛋白質不應該有等電點上的改變，分子量上的改變也應該保持最小，而且不同熒光染料導致的分子量的改變應該一致。用于蛋白質預先標記的熒光染料分為兩類，最小標記和飽和標記。其中最小標記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學結構上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團－NHS脂，可以特異性的標記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應蛋白質的等電點不會發生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標記會導致蛋白質的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質的賴氨酸殘基被熒光標記修飾，才可以維持被標記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標記樣品時，保證合適的蛋白質和染料的摩爾數比例至關重要。通過調整合適的pH值、合適的染料和蛋白質的摩爾比，可以保證每個蛋白質分子最多只標記上一個染料分子，來保證蛋白質的分子量變化最小。

飽和標記的熒光染料包括兩種，標記蛋白質上的半胱氨酸殘基，主要用于一些來源和珍貴的微量樣品的研究中。飽和標記可避免上述問題，但是使用成本較高。在采用飽和標記分析蛋白質組樣品時，必須先進行染料量的滴定，以確定合適的還原劑和染料的加量，否則，在DIGE膠圖上很輕易造成水平鏈狀的點或垂直拖尾。另外，由于被標記了的蛋白質的分子量發生了改變，飽和標記的膠圖和銀染的膠圖有所不同。

DIGE中的學問相當大，簡單幾段話可說不清楚，如果有同學想了解更多，可以讀讀這一篇《定量蛋白質組學研究中的熒光差異凝膠電泳技術》。

磷酸化蛋白

上面提到的是總蛋白染料，它可不分蛋白類型，只要是蛋白，就通通不放過。有時，你的目標僅僅是磷酸化蛋白，那么需要特異的磷酸化蛋白染料。2003年，Molecular Probes公司的Wayne Patton等在JBC上報道了一種全新的熒光染料Pro-Q Diamond，它可對磷酸化基團（連接在酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基上）特異性染色。該方法方便、快捷且具有較高的靈敏性，線性范圍超過3個數量級，與質譜鑒定兼容。之后他們又將一些蛋白質和肽段點樣在蛋白芯片上，然后利用Pro-Q Diamond 來檢驗芯片上的蛋白質及多肽的磷酸化水平，靈敏度可達到312-625 fg，這種芯片與染料的結合為研究信號通路及磷酸酶抑制物提供了一個很好的平臺。Pro-Q Diamond染料還可與SYPRO Ruby共同使用，來檢測總蛋白中的磷酸化蛋白。

糖基化蛋白

對于糖基化蛋白，Molecular Probes則提供了Pro-Q Emerald 300和488糖蛋白染料。Pro-Q Emerald 300能與高碘酸鹽氧化的碳水化合物基團相互作用，讓糖基化蛋白產生明亮的綠色熒光。這種方法能檢測低至0.5 ng的糖蛋白，比酸性品紅染料靈敏50倍。Pro-Q Emerald 300的激發和發射波長分別為280 nm和530 nm，可用紫外透射儀觀察。它也能與SYPRO Ruby共用，來檢測糖基化情況。另外，Pro-Q Emerald系列還有另一個成員- Pro-Q Emerald 488，激發波長在510 nm，也是發綠色熒光。它的靈敏度比前者稍遜，為4 ng。它們倆都與質譜分析兼容。

PIERCE也有一款糖基化蛋白的染料Krypton Glycoprotein Staining Kit，能夠檢測1-D和2-D膠中的糖基化蛋白。與Pro-Q Emerald 300相比，它的靈敏度不算出眾，僅為15 ng。優勢也是速度快，對于一般的迷你膠，染色過程4個小時，如果是那種很大的2-D膠，4.5小時也可完成。它與質譜分析兼容，也能與前面提到的總蛋白染料Krypton Protein Stain共用。

His標簽蛋白

目前的重組蛋白大多帶有His標簽，便于檢測和純化。怎么檢測？不外乎是Western blot。其實Invitrogen還有一種很方便的熒光染料，可以大大簡化His蛋白的檢測。InVision™ His-tag In-gel Stain中的熒光染料是與Ni2+：NTA復合物結合在一起的。眾所周知，Ni2+與組氨酸序列有著高度的親和力，因此它能特異識別帶His標簽的蛋白。整個染色過程不到3個小時，比Western blot可快多了。如果你用微波爐來幫忙，快速染色只需70分鐘。它的靈敏度也不賴，能夠檢測0.5 皮摩爾6×His重組蛋白，假設蛋白分子量為30 kDa，則檢測極限為15 ng。檢測系統可以是紫外透射儀，也可以是激光掃描儀。對于經常表達重組蛋白的實驗室來說，可真是個好東西，價格也還可以接受，500 ml/ 3882元。用了這個，His抗體和轉印膜都能省了。

另外，Invitrogen還有一款與這個類似的染料，染的是帶Lumio™標簽的蛋白。不過Lumio標簽用戶不太多，這里就不詳細介紹了。感興趣的同學可讀讀《使用Lumio™技術快速檢測體外表達的蛋白質》。

蛋白染料看似很簡單，原來也有這么多學問，希望大家看完沒有頭暈暈。至于染料的價格，本文沒有一一列出，大家可到生物通商城查詢。（生物通 余亮 吳青）

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