2008年10月8日，諾貝爾化學獎揭曉。日本科學家下村修、美國科學家馬丁•查爾非和錢永健因發現和改造綠色熒光蛋白（GFP）而獲獎。因諾貝爾獎和錢永健，熒光蛋白再次成為我們關注的熱點。1962-2009，這47年來，熒光蛋白也在不斷進化。不過這種進化不是出于自然選擇，而是成像上的壓力。

讓我們先來了解一些關于始祖GFP的基本情況。GFP由238個氨基酸組成，分子量為26.9 kDa，最初是從維多利亞多管發光水母（Aequorea victoria）中分離出來的，在藍光照射下會發出綠色熒光。來源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分別有主要和次要的激發峰，它的發射峰在509 nm，處于可見光譜的綠色區域。來源于海腎的GFP只在498 nm有單個激發峰。

GFP是典型的β桶形結構，包含β折疊和α螺旋，將熒光基團包含在其中。嚴密的桶形結構保護著熒光基團，防止它被周圍環境淬滅，內部面向桶形的側鏈誘導Ser65–Tyr66–Gly67三肽環化，導致熒光基團形成。

1962年，下村修和約翰森從維多利亞多管水母中分離生物發光蛋白-水母素（aequorin）時，意外地得到了一個副產物。它在陽光下呈綠色、鎢絲下呈黃色、紫外光下發強烈綠色。其后他們仔細研究了其發光特性。1974年，他們得到了這個蛋白，當時稱綠色蛋白，以后稱綠色熒光蛋白（GFP）。GFP在水母中之所以能發光，是因為水母素和GFP之間發生了能量轉移。水母素在鈣刺激下發光，其能量可轉移到GFP，刺激GFP發光。這是物理化學中已知的熒光共振能量轉移(FRET)在生物中的發現。

研究者們并沒有意識到GFP的應用前景，慢慢就將其遺忘了。這一晃就是20年。直到1992年，道格拉斯•普瑞舍克隆并測序了野生型的GFP，文章發表在《Gene》雜志上。但具有諷刺意味的是，基金評審委員會認為普瑞舍的工作沒有意義，不愿提供經費。普瑞舍一氣之下，離開了科學界，將GFP的cDNA送給了幾個實驗室。很多人嘗試用GFP的基因來表達蛋白，但都失敗了。馬丁•查爾非就考慮只用它的編碼區域來表達。他用PCR的方法擴增了GFP的編碼區，將它克隆到表達載體中，通過UV或藍光激發，在大腸桿菌和線蟲細胞內均產生了很美妙的綠色熒光。這才是GFP作為熒光指示劑的真正突破，文章發表在《Science》雜志上。

盡管野生型GFP發出很絢麗的熒光，但它還是有不少缺點，比如有兩個激發峰、光穩定性不好，在37℃不能正確折疊。

1996年Remington小組最先在《Science》上發布了GFP的S65T突變體的晶體結構。一個月后，Phillips小組也在《Nature Biotech》上發布了野生型的GFP結構。正是這些晶體結構的探明，才使人們更好地了解發光基團的組成，以及與周圍殘基的相互作用。研究人員通過定點或隨機突變，不斷地改造這些殘基，得到了我們今天使用的GFP衍生物。

首個重大改變就是錢永健在1995年完成的單點突變（S65T）。這個突變顯著提高了GFP的光譜性質，熒光強度和光穩定性也大大增強。突變后的GFP激發峰轉移至488 nm，而發射峰仍保持在509 nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應用潛力。而F64L點突變則改善了GFP在37℃的折疊能力，綜上就產生了增強型GFP，也就是我們常見的EGFP。

熒光蛋白的改造遵循這樣一個宗旨，那就是越紅越好。普遍認為，長波長光子的激發對細胞和組織的光毒性小，且自體熒光和動物組織的光吸收都是最小。這些因素意味著紅色的熒光基團對比度提高（因為背景應該降低），且更適合于體內成像。于是，熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移。最初是黃色熒光蛋白，1999年人們在銀蓮花中發現了橙紅色的熒光蛋白同源物，稱之為DsRed（發射峰在583 nm）。DsRed的出現讓研究人員認識到熒光蛋白的多樣性，同時也有了更豐富的改造模板。之后，更長波長的熒光蛋白也陸續出現，如mStrawberry、mCherry（2004）、mApple（2008）、mRuby（2009），它們的名字也都相當動聽。

對于活體動物成像而言，最好工具是遠紅外熒光蛋白。然而，要產生遠紅外熒光，這些蛋白需要被600 nm左右或以上的光激發，但這些光在到達深處的組織之前，就已被血紅蛋白大幅度減弱。因此，到現在為止還未開發出激發光譜在700 nm附近的熒光蛋白。遠紅外熒光蛋白的開發遇到了瓶頸。

實際上，大自然蘊含的豐富資源已經解決了這個問題，只是我們不知道而已。錢永健的實驗室最近揭開了謎底。他們沒有像慣常一樣，從紅色熒光蛋白開始，將它們改造得更亮，而是從一種新的骨架來開發紅外熒光蛋白。他們從一種耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的細菌光敏色素骨架入手，這種光敏色素吸收700 nm左右的光。它還結合了一種名為膽綠素的輔因子，作為發色團。

利用飽和突變和DNA改組（DNA shuffling）來改變膽綠素發色團的蛋白殘基，錢永健及他的同事們發現了一種光穩定的紅外熒光蛋白突變單體，它的激發波長是684 nm，發射波長是708 nm。當他們利用腺病毒載體在小鼠肝臟表達這種突變體時，觀察到強烈的紅外熒光。

除了體內成像應用，這種紅外熒光蛋白還能用于細胞成像。它的顏色與目前存在的熒光蛋白不同。而且，紅外區域的細胞自體熒光幾乎是不存在的，因此提供了更清晰的圖像。此外，它還能在熒光共振能量轉移（FRET）中發揮作用。錢永健實驗室的研究人員表示，紅外熒光蛋白應該不會局限于耐輻射奇球菌的光敏色素，還存在許多種細菌光敏色素，它們的吸收最大值在650到750 nm之間。這些也是紅外熒光蛋白的有力候選，它們能用于多色成像、以及體內FRET成像的供體或受體。

綠色熒光蛋白不再是孤獨的，它有了橙色、紅色等多種熒光蛋白的陪伴。然而，要找到個“門當戶對”的伴侶也不容易。就融合應用、亮度、光穩定性而言，與EGFP相似的還真沒有。而且，一些紅外熒光蛋白仍保留了基本的綠色熒光組件，因此不可能與EGFP一起應用于兩色成像。科學家的近期目標是開發出與EGFP各方面都匹配的紅色熒光蛋白。當然，紅色熒光蛋白變異體的改造仍在持續。

熒光蛋白已經給生物學帶來了很多驚喜。通過常規的基因操縱手段，用熒光蛋白來標記其他目標蛋白，這樣就可觀察、跟蹤目標蛋白的時間、空間變化，提供了以前不能達到的時間和空間分辨率，而且可以在活細胞、活體動物中觀察到一些分子。熒光蛋白甚至協助了HIV研究。

德國的研究人員就開發出一種光轉變熒光蛋白（photoconvertible fluorescent protein），能觀察HIV在感染的細胞中如何裝配及釋放。這種名為EosFP的光轉變蛋白發出強烈的綠色熒光，在紫外照射下會轉變為紅色。紫外光通過打斷發色團旁邊的肽骨架而改變了蛋白的發射波長。這樣EosFP就稱為一種極佳的失蹤標記。研究人員將EosFP與HIV的結構蛋白-Gag相連，實時追蹤了病毒顆粒在感染的細胞膜上如何裝配并釋放。光轉變熒光蛋白讓研究人員又多了一種選擇。

熒光蛋白的下一個驚喜將會是什么？我們無法回答，但我們期待著。