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circRNA的定義和特征
環狀RNA (circRNA)是一類新的具有調控功能的非編碼RNA，具有閉合環狀結構，大量存在于真核轉錄組中。大部分的環狀RNA是由外顯子序列構成，在不同的物種中具有保守性，同時存在組織及不同發育階段的表達特異性。由于環狀RNA對核酸酶不敏感，所以比線性RNA更為穩定，這使得環狀RNA在作為新型臨床診斷標記物的開發應用上具有明顯優勢。
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circRNA在哺乳動物細胞中的形成
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circRNA特征
• circRNA沒有“尾巴”
常規存在于線性RNA分子中的3’和5’端在環狀RNA中被連接形成了閉合環狀結構（圖1）。而經典的RNA檢測方法只能分離具有PolyA“尾巴”結構的RNA分子，所以環轉RNA在以往的研究中通常被忽略了。
• circRNA不翻譯
雖然很多circRNA是由蛋白編碼基因產生，但是還沒有結果顯示circRNA在細胞中編碼蛋白。環狀RNA也因此被定義為一類新型非編碼RNA。
• circRNA的細胞定位和穩定性
大部分環狀RNA在細胞漿中富集，其豐度有時甚至比相應的線性mRNA高10余倍，這可能是由于環狀RNA比線性RNA更穩定造成的。核酸酶往往通過識別線性RNA分子末端發揮作用，環狀RNA是一個閉合結構，因此對核酸酶具有高耐受性。
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國家自然科學基金為何如此“鐘愛”circRNA
近年來circRNA研究如火如荼，國內研究也緊抓熱點，這一點從國家自然科學基金的傾向性可見一斑：從2016年的約80項circRNA相關項目，到2017年的176項（包括2項杰出青年基金，1項優秀青年基金，2項重點項目，94項面上項目，62項青年基金項目，15項地區科學基金項目） ，再到2018年的200多項（包括87項面上項目，11項地區基金項目，65項青年基金項目等）。
其中，腫瘤學項目獲批最多，如中科院生物物理所的“環形RNA CircDcun1d4調控肝癌干細胞自我更新的作用及分子機制研究”，中山大學的“環狀RNA介導腫瘤相關巨噬細胞促進肺癌轉移研究”等等。
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circRNA的發展路程
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1971年，研究者發現類病毒（Viroids）能侵染植株并導致死亡，與病毒不同的是，類病毒沒有蛋白質外殼包被，基因組是單鏈、閉合、RNA分子。
1993年，在小鼠精子決定基因Sry中發現環狀轉錄。
2006年，在果蠅中發現來自于Muscleblind的未知環狀轉錄本。
2012年，Salzman通過RNA-Seq方法首次報道了~80個環狀RNA。至此借助于高通量測序技術，circRNA才真正為自己正名。大量的circRNA分子被相繼發現。
2013年，Nature雜志兩篇重要的研究論文揭示出一些環狀RNA充當分子“海綿”，結合并封閉了microRNAs。自此，環狀RNA在科學界受到了前所未有的關注。
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1979年，洛克菲勒大學的Hsu和Coca-Prados在電子顯微鏡下觀察到的真核細胞細胞質中觀測到環狀RNA的存在。
2014年，circRNA逐漸成為了RNA領域的研究熱點，Arraystar公司全球首推第一款商業化circRNA芯片。
2015年，中國農業科學院植物保護研究所研究員李世訪與中國科學技術大學吳清發教授合作，在世界上首次發現蘋果中存在具有核酶活性的環狀RNA。
2017年，德國科學家發現環狀RNA與大腦功能存在關聯。
2018年，越來越多的研究證實環狀RNA與癌癥密切相關，有望成為癌癥生物標記物
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“過去，人們大多把circRNA看作是奇怪的現象。隨著二代測序的發展，最近四五年人們發現這些分子其實是
非常普遍的。這一全新領域在很短時間內得到了飛速發展。”
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——希伯來大學的Sebastian Kadener |
circRNA的功能與作用
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circRNA競爭性吸附miRNA
circRNA與相應microRNA結合，像“海綿”吸附miRNA，使miRNA無法與靶基因結合，進而共同參與調控靶基因的表達。這一作用機制被稱為競爭性內源RNA（ceRNA）機制。通過與疾病關聯的miRNA相互作用， circRNA在疾病中發揮著重要的調控作用，這一點是目前circRNA最主要的研究思路。
circRNAs調控可變剪切或轉錄過程
circRNA通過堿基互補配對直接調控其他RNA水平，circRNA可能參與蛋白翻譯。一直被認為是非編碼RNA的circRNA也能編碼多肽，并通過其行使功能。circMbl是由剪切因子MBL的第二個外顯子環化而來，競爭mRNA的線性剪切。CircMbl的側翼外顯子和自身序列包含MBL特異性結合的位點。MBL的表達水平受到circMbl的調控影響。研究表明，MBL通過調整circRNA形成和線性可變剪切之間的平衡來影響可變剪切過程。formin（Fmn）基因可以通過backsplicing形成circRNA。該circRNA包含翻譯起始位點作為“mRNA trap”，形成一個非編碼線性轉錄本而減少Fmn蛋白的表達。
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circRNA調節RNA結合蛋白（RBP）
circRNA能與蛋白質結合，抑制蛋白質活性、募集蛋白質復合體的組分或調控蛋白質的活性, circRNA可能參與蛋白翻譯。一直被認為是非編碼RNA的circRNA也能編碼多肽，并通過其行使功能。
circRNA與大腦功能
circRNA可能對大腦功能很重要。比如說，一種名為CDR1的哺乳動物circRNA在神經元中含量很高，神經元基因經常產生circRNA轉錄本，在衰老過程中circRNA會在果蠅大腦中累積。不過人們沒能全面了解哺乳動物大腦中的circRNA。
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“理解環狀RNA在大腦或其他器官中的功能，將是生物學的重大進步。”
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——斯坦福大學的分子生物學教授Julia Salzman |
circRNA的研究思路與方法
以中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組2018年發表在國際知名學術期刊Immunity（IF=22.845）的文章為例：
（芯片實驗由康成生物提供技術服務）
研究人員利用Arraystar Mouse CircRNA Array研究了小鼠骨髓細胞（BM）中分離的長期造血干細胞（LT-HSCs）和多能干細胞（MPPs）的circRNAs表達譜，篩選出一個在LT-HSCs細胞核高表達的circRNA cia-cGAS，可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS相互結合并抑制其酶活性，阻礙cGAS結合基因組DNA，從而不能激活I型干擾素（IFN）的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態。該研究同時也發現cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫相關的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發靶標。研究成果2018年發表在國際知名學術期刊Immunity（IF=22.845）。
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一、研究背景
長期造血干細胞（LT-HSCs）是潛能最高的干細胞系，具有最高的更新和分化能力，可以為短期造血干細胞、多能干細胞（MPPs）等提供了持續性細胞補給。大多數時候，LT-HSCs處于休眠的靜息狀態，其干性的維持受多種因素的影響。
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二、研究思路+技術路線
Step 1 篩選
研究人員通過Arraystar Mouse CircRNA芯片分析了小鼠骨髓中分離的長期造血干細胞LT-HSC與多能干細胞MPPs的circRNAs表達譜，篩選出156種差異表達的circRNAs。qPCR驗證結果與芯片一致。
Step 2 鑒定
shRNA慢病毒轉染發現，只有D430042O09Rik基因轉錄的circRNA cia-cGAS可以影響LT-HSCc的亞群分布。
Step 3 表達分析
隨后研究人員通過qPCR、Northern blot、核質分離及原位雜交實驗發現cia-cGAS在LT-HSCs的細胞核內高度表達。
Step 4 功能分析
接下來作者對cia-cGAS的相關功能進行了研究。作者通過刪除下游的反向互補序列特異性敲除cia-cGAS，FACS分析表明敲除后LSK細胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，并且敲除后LT-HSCs的BrdU染色陽性率明顯高于對照組，表明敲除后LT-HSCs處于活躍的增殖階段。脈沖標記也顯示敲除后LT-HSCs細胞靜息狀態的比例顯著降低。然后作者通過對敲除小鼠的mRNA表達譜分析發現I型IFN表達顯著上調，qPCR和ELISA也驗證了這一結果。以上實驗表明cia-cGAS可以通過I型IFN信號傳導調控LT-HSCs的靜息狀態。
Step 5 分子機制分析
最后作者對cia-cGAS發揮功能的分子機制進行了探討。RNA pull down、RIP、免疫熒光、EMSA和FISH實驗發現cia-cGAS可以和cGAS蛋白相互作用。接下來作者通過酶活測定、ChIP、HPLC、熒光素酶和質譜實驗表明cia-cGAS可以阻礙cGAS與LT-HSCs自身DNA結合，從而抑制其酶活性，不能激活I型IFN的表達。然后作者用CRISPR/Cas9突變cGAS基因，qPCR、ELISA、BrdU標記等實驗表明，突變后I型IFN表達被抑制，LT-HSCs細胞數量正常且更多的維持在靜息狀態。這些均表明了cia-cGAS作用的機制就是通過結合cGAS抑制其表達，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSC的靜息狀態。動物實驗顯示，在cia-cGAS敲除的小鼠中，poly（I:C）與HSV病毒的刺激均可導致大量I型干擾素的產生，從而誘發自身免疫性疾病，而cia-cGAS過表達則可以消除這些，表明cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫疾病的有效抑制劑。
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第二個例子：看曹雪濤院士如何做circRNA研究！ |
曹雪濤院士課題組和第二軍醫大學于益藝教授課題組合作在肝臟領域頂尖雜志Hepatology（IF=13.246）發表了題為“Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression”的文章，研究失調的circRNA和肝癌中的功能。
（芯片實驗由康成生物提供技術服務） |
一、研究背景
肝細胞癌（HCC）是一種高死亡率的原發性肝癌，是最常見的惡性腫瘤之一。一些內源性的非編碼RNA如circRNA在發育、細胞功能和特定的病理學應答中發揮重要作用，使得對失調的非編碼RNA在癌癥生物學中的作用的研究越來越引起人們重視。
二、研究思路+技術路線
Step 1 篩選——從臨床樣本出發，通過高通量芯片篩選結合qPCR驗證得到目標circRNA。
作者選擇了7例HCC組織及其相應的正常組織對照，用高通量circRNA microArray進行分析，篩選出肝細胞癌中20個差異最為顯著的CircRNA做聚類分析——其中包括10個circRNA顯著上調，10個circRNA顯著下調，qPCR驗證了這20個circRNA與芯片結果一致。
Step 2 鑒定——鑒別并確認目標circRNA，并在更大量臨床樣本中確認普遍性
作者對來源于21個病人的HCC樣本中對上述20個circRNAs的表達情況進行了驗證，確認circMTO1 （has_circRNA_0007874/has_circRNA_104135）在HCC組織中顯著下調。繼續放大樣本量，結果發現相對于正常肝組織，circMTO1在87.4%（228/261）的肝癌組織中表達顯著下降。用過組織原位雜交（ISH）等方法表明，HCC組織中circMTO1表達越低，HCC病人的預后越差，circMTO1與HCC病人的惡性程度相關。
盡管還有幾個候選circRNA（circARID1B, circFAM13B, 和circFARP2）在HCC樣本中也有下調，但是沉默這些circRNAs對HCC細胞的生長沒有明顯的影響，而沉默circMTO1會明顯促進HCC細胞的增殖。
Step 3 表達分析
用組織原位雜交（ISH）等方法分析116例帶有生存數據的樣本，結果表明，HCC組織中circMTO1表達越低，HCC病人的預后越差，circMTO1與HCC病人的惡性程度相關。
Step 4 功能分析
過表達或敲除實驗表明circMTO1會影響肝細胞癌的增殖，體內實驗也證實了這一結果。
Step 5 分子機制分析——以circRNA的ceRNA機制為基礎，預測并篩選出circRNA結合的miRNA，檢測其下游靶基因，對其分子機制進行深入研究
通過Miranda預測circMTO1能結合99個microRNA。為了確定到底是哪些miRNAs可以與circMTO1結合，作者用circMTO1特異性的探針對這99個miRNAs進行了RIP（RNA in vivo precipitation）篩選。作者著重分析了早前報道的20個可以在HCC中起作用的miRNAs，結果發現miR-9明顯富集，從而確定circRNA可以和miR-9結合。
通過FISH實驗表明，circMTO1確實可以與miR-9在胞質中共定位，表明circMTO1確實可以與miR-9在胞質中結合。且HCC樣本中的共定位明顯少于正常組織。
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后繼研究
研究人員在HCC細胞中沉默circMTO1，以研究circMTO1對HCC進展的影響以及與miR-9的相互作用。作者檢測了8個細胞系中circMTO1和miR-9的表達情況，結果發現，SK-Hep1相比中circMTO1表達最低，miR-9表達最高，QGY-7701細胞中兩種RNA的表達都適中， HepG2和SMMC-7721細胞中的circMTO1表達較高，而miR-9的表達較低。
因此，研究人員選擇在HepG2和SMMC-7721細胞中沉默circMTO1。作者在circMTO1的接口處設計了siRNA，在HepG2和SMMC-7721細胞中轉入siRNA后通過qPCR進行了檢測，結果表明沉默circMTO1明顯促進了細胞增殖，增強了細胞的侵襲，并且減少了凋亡。另外在HepG2和SMMC-7721細胞中過表達miR-9與沉默circMTO1效果相似。
研究人員還構建了circMTO1的過表達系統，在SK-Hep1和QGY-7701細胞中過表達circMTO1，明顯促進了細胞的凋亡。
研究人員還發現，過表達和沉默circMTO1都不會影響miR-9的表達水平，這說明circMTO1是通過“海綿吸附”來抑制miR-9的功能的。
為了進一步證實circMTO1是否是通過“海綿”吸附miR-9來發揮抗腫瘤的作用的，研究人員檢測了腫瘤抑制基因p21的表達情況（p21也是miR-9的靶基因），結果表明，無論是沉默circMTO1還是轉入miR-9的mimics，在HCC細胞中都可以明顯減少p21的mRNA和蛋白水平。過表達circMTO1則可以增加p21的mRNA和蛋白水平。這說明circMTO1可能是通過防止p21被miR-9下調來行使其抗腫瘤作用的。
接下來，研究人員實驗表明，當加入miR-9的抑制劑時，p21的mRNA和蛋白水平都不再被下調了，circMTO1沉默也不再促進細胞增殖和抑制細胞凋亡了。這可以說明，加入miR-9的抑制劑可以阻斷沉默circMTO1的作用。
體內實驗
最后作者又建立了一個HCC的裸鼠模型（SMMC-LTNM），通過尾靜脈注射circMTO1的siRNAs，兩周之后發現，腫瘤生長加速了，血清中AFP的水平明顯增加。尾靜脈注射siRNAs48h后SMMC-LTNM的腫瘤組織中circMTO1和p21的表達水平明顯減少。另外，內源性敲低circMTO1也會抑制p21及其下游CDK2的表達，而細胞侵襲和增殖的marker MMP2和PCNA則上調。這些數據表明circMTO1可以在體內抑制HCC的進展。
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Tips——研究circRNA的思路（來源：網絡）
一、篩選circRNAs。常用方法：高通量芯片篩選，RNA-seq等
二、驗證與鑒定circRNA+表達分析。常用方法：Q-PCR，FISH，Northern等
circRNA的RT-PCR驗證特別之處。
常規PCR引物只針對目的片段的上下游進行設計，而circRNA引物可分以下兩種方式設計：
1）外顯子環化circRNA，需要特異性針對剪切位點處（backsplice junction site)來設計primer；
2）內含子環化circRNA，可跨剪切位點設計，也可圍繞內含子區域設計引物。另外，circRNA引物設計建議還需要滿足擴增產物長度不超過100bp；且內參基因不能選用線性mRNA，可采用外參彌補。
circRNA表達的組織特異性驗證：用原位雜交技術（Situ Hybridization）進行驗證。設計雜交探針時要跨backsplice junction位點，而后可很清楚的看到circRNA在哪些組織中表達很高，作為組織特性判斷的依據。細胞定位是決定調控機制研究方向的關鍵。
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三、circRNA功能分析常用方法：正向驗證——circRNA過表達；反向驗證——circRNA沉默/敲除
正向驗證——circRNA過表達
目前比較公認的成環機制為circRNA側翼序列的堿基互補配對，稱之為Alu結構。基于此，可用PCR擴增含側翼Alu序列的目標DNA序列，而后依據相應限制性內切酶位點進行酶切，連接至pEGFP-C1載體中。將連接載體轉染相應細胞樣本，定量PCR檢測轉染效率。最后用divergent primer驗證circRNA過表達倍數。
過表達策略：1.擴增目標區域包含circRNA側翼Alu序列或內部堿基互補序列，側翼上下游1kb處過表達效率更佳；2.目標區域擴增基于基因組DNA為模版。
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反向驗證——circRNA沉默
沉默circRNA，可用siRNA沉默，即針對circRNA 的backsplice junction位點前后序列設計siRNA；而對于內含子環化circRNA，還可針對內含子區域設計相應siRNA。最后利用Divergent primer驗證circRNA敲除倍數。此外，每個siRNA設計相應的對照（backsplice junction位點一端互補配對，另一端錯配)。 |
四、circRNA機制研究
目前針對circRNA的功能機制研究不多，潛在的調控基因表達和蛋白合成方式有：
1）circRNA可以作為“sponge”海綿吸miRNA，調節靶基因；
2) circRNA能與蛋白質/RNA結合,募集蛋白質復合體的組分或調控基因的表達；
3）circRNA通過堿基互補配對直接調控其他RNA水平。
一般來說，ceRNA調控機制是circRNA作用機制研究的首選，因而很多文章優先從ceRNA的角度去解釋其作用機理。而circRNA作為miRNA的“sponge”有兩個基本前提：
1）circRNA和mRNA有共同的miRNA結合位點。
2）circRNA影響其競爭結合對象mRNA的表達。
首先用RNA-FISH確認circRNA在細胞中的定位。細胞定位是決定調控機制研究方向的關鍵。轉錄后調控尤其是ceRNA調控，一般認為在細胞質中進行，如果該circRNA主要定位于細胞質，那么是有可能成為ceRNA分子的。
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尋找靶定circRNA的miRNA及miRNA靶定的mRNA。
1）利用生物信息學對其進行預測，即通過miRcode/starBase篩選circRNA潛在的miRNA結合位點（MRE），同時通過miRTarBase預測miRNA的靶基因。而后用通過熒光素酶報告系統及免疫共沉淀（RIP）進行驗證circRNA和mRNA之間的表達呈正相關性。
2）也可直接通過circRNA+mRNA組合芯片高通量篩選，分析差異表達circRNA和mRNA之間的表達相關性分析，尋找與circRNA關系密切的mRNAs |
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最后，驗證circRNA對miRNA及其下游靶基因的表達影響。這部分可通過過表達和沉默circRNA中檢測mRNA的變化，過表達和沉默mRNA來檢測circRNA的變化以及circRNA和mRNA表達相關性分析加以驗證。
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其它案例
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這篇題為“CircNT5E acts as a sponge of microRNA-422a to promote glioblastoma tumorigenesis ”的文章，對GBM相關的非編碼RNA進行了深入研究，發現 circNT5E能夠作為miRNA-422a的海綿吸附體，抑制其活性，進而影響膠質母細胞瘤的腫瘤發生。
篩選分子
作者收集３對臨床GBM樣本，進行高通量檢測，對其中差異表達的RNA進行生物信息學分析，挑選了548個表達上調的circRNA/lncRNA進行進一步的研究。通過TargetScan預測，確定38個高潛在的miRNA-442a海綿吸附體，并利用生物素標記的miRNA pulldown實驗，鎖定了目標circRNA—hsa_circ_0077232 (circNT5E)。
circNT5E介導的GBM表型研究
在確定目標后，就要研究一下circNT5E是不是會對GBM表型有影響，研究者使用FISH檢測了正常，WHO I，WHO II，WHO III和WHO IV膠質瘤組織中的circNT5E。結果顯示，隨著臨床分類的增加，circNT5E的表達水平顯著增加（下圖a-b）。
在配對的GBM腫瘤組織（n = 18）中進行的qRT-PCR測定顯示腫瘤組織中circNT5E表達顯著高于正常組織（下圖c）。這些結果表明circNT5E在膠質瘤中起著致癌基因的作用，從而促使我們研究circNT5E的功能。而后檢查細胞活力，增殖，凋亡，侵襲和遷移能力。
體內外實驗表明，circNT5E不僅對GBM細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲有一定的影響，還能有效促進體內GBM腫瘤的形成。
circNT5E如何行使功能
確認過表型，是遇見對的circRNA～
研究者要對circNT5E在GBM中如何行使其功能進行研究。綜合考慮生物素標記的miRNA pulldown實驗結果，circNT5E的編碼能力以及circNT5E大量穩定存在于GBM細胞質中的事實，研究者選擇從ceRNA的角度來進行深入分析。
研究結果表明，circNT5E可直接結合miRNA-422a，作為其海綿吸附體影響下游靶基因的表達。
進一步實驗表明，circNT5E能夠通過與miRNA-422a的結合，解除miRNA-422對其下游靶基因的抑制作用，進而影響GBM細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲。
研究者利用高通量的方法篩選了GBM相關的非編碼RNA，circNT5E可通過海綿狀膠質母細胞瘤抑制因子miRNA發揮額外的調節功能。 這些結果為開發膠質母細胞瘤的新型治療方法提供了意見。
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第二例：PRMT5 Circular RNA Promotes Metastasis of Urothelial Carcinoma of the Bladder through Sponging miR-30c to Induce Epithelial–Mesenchymal Transition. Clinical Cancer Research. 2018circPRMT5通過ceRNA機制誘導上皮間質轉化，促進膀胱尿路上皮癌轉移
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中山大學腫瘤防治中心附屬腫瘤醫院謝丹課題組利用Arraystar circRNA 芯片研究發現在circPRMT5與膀胱尿路上皮癌（UCB）的晚期病人與生存較差的病人中存在正相關。而后功能研究發現circPRMT5可以通過吸附miR-30c促進UCB細胞的上皮間質轉化（EMT）。臨床研究發現circPRMT5/miR-30c/SNAIL1/E-cadherin通路對于UCB增殖極其重要，而且circPRMT5在UCB臨床病人的血清和外泌體中都上調表達。該研究成果發表在學術期刊Clinical Cancer Research（IF: 9.619）。
（芯片實驗由康成生物提供技術服務） |
研究背景：
膀胱尿路上皮癌具有較高的發病率，是世界上最常見的惡性腫瘤之一。迄今為止，還沒有針對UCB轉移特效藥。因此深入研究UCB的腫瘤發生及轉移的分子機制，可以為UCB臨床患者提供更有效的抗腫瘤治療方式。
circRNA是一類共價閉合的環狀RNA，可以通過外顯子跳躍和反向連接形成環狀RNA。在不同的生理條件下，環狀RNA的表達具有極強的動態性。近來研究發現，circRNA可以通過吸附miRNA參與到腫瘤的發生過程，因此circRNA也是一類有前景的腫瘤診斷和治療的分子標志物。但circRNA是如何參與腫瘤的EMT過程，其分子機制仍不為人知。
外泌體是一類從細胞釋放到胞外微環境的直徑在30-100nm之間的具有膜結構的盤狀小囊泡，其內包裹著miRNA、mRNA和蛋白，行駛著胞間信息交流的功能。最近，已有文章證實腫瘤細胞可以釋放包含著circRNA的外泌體到血清中，但其病理學功能仍未知。UCB病人的血液和尿液中外泌體的數量有明顯的上升，研究UCB病人的外泌體包含的circRNA及其分子功能，具有重要的臨床意義。 |
研究思路：
文章著重于研究circPRMT5在UCB臨床病人中的功能和機制研究 |
Step 1 篩選+鑒別+表達分析
作者運用Arraystar circRNA芯片檢測UCB的腫瘤組織和正常組織中circRNA的表達量，通過差異倍數、p值、FDR值篩選之后，發現circPRMT5的表達量在腫瘤組織中上調最明顯。隨后，作者收集119對UCB腫瘤組織和配對的正常膀胱組織，通過qPCR驗證了circPRMT5在UCB腫瘤組織中普遍上調。 |
Step 2 功能分析+分子機制
為了研究circPRMT5在UCB組織中的功能，作者構建了覆蓋circPRMT5反向剪切位點的shRNA，結果顯示敲低circPRMT5之后，明顯抑制UCB細胞的遷移和侵襲能力。另一方面，過表達circPRMT5可以增強UCB細胞的遷移和侵襲能力。動物模型顯示，通過小鼠尾靜脈注射穩定敲低circPRMT5的T24細胞系（UCB細胞系），小鼠的肺部轉移灶顯著減少；注射過表達circPRMT5的細胞系，肺部轉移灶明顯增加。
機制研究顯示，通過AGO2 RIP實驗，circPRMT5可以與AGO2結合，進入RISC復合物。雙熒光素酶報告系統顯示，circPRMT5可以作為miR-30c的吸附海綿。使用生物標記的circPRMT5探針，拉取與circPRMT5相互作用的miRNA，發現miR-30c可以被富集。FISh實驗驗證circPRMT5與miR-30c在細胞內可以被共定位，因此作者挑選miR-30c作為circPRMT5的靶標進行后續研究。
后續研究證實，circPRMT5促進UCB細胞遷移和EMT是通過吸附miR-30c，降低miR-30c的抑制效應的方式行使功能。而且circPRMT5通過調控miR-30c/SNAIL1/E-cadherin通路，進而促進UCB細胞的EMT過程。最后，作者收集了正常人與UCB病人的血清和尿液中的外泌體，qPCR實驗顯示從UCB患者的血清和尿液分離的外泌體中circPRMT5的表達量更高，miR-30c的表達趨勢，與circPRMT5的表達趨勢呈明顯的負相關。 |
研究意義：
本研究運用Arraystar CircRNA 芯片研究膀胱尿路上皮癌（UCB）組織中circRNA的表達和功能。發現circPRMT5的表達在UCB組中顯著升高，并且與UCB病人差的預后相關。功能和機制研究發現，circPRMT 5通過海綿吸附miR-30c，調控SNAIL/E-cadherin信號通路，促進UCB細胞系的EMT途徑和侵襲能力，意味著circPRMT5在UCB的轉移過程中起著促進作用。進一步，體內干預circPRMT5實驗表明circPRMT5是一個新的原癌環狀RNA分子。結果不僅僅闡釋了UCB轉移的新機制，也表明circPRMT5可作為UCB治療的靶標。
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circRNA與疾病
近來研究開始關注于circRNA可能在疾病病理方面起到的作用。例如，環狀ANRIL（cANRIL）是長鏈非編碼RNA ANRIL的環狀拼接形式，其在人類細胞中的表達與該位點上幾個可能影響ANRIL拼接的SNP有關，能調節INK4/ARF的水平并增加動脈粥樣硬化的風險。這項研究充分證明circRNA與疾病的發生存在關聯，并能很好地作為疾病新型生物標記。
此外，更多的證據顯示，環狀RNA在miRNA水平的微調上起著非常重要的作用，通過競爭結合miRNA來調控基因的表達。而與疾病關聯miRNA的相互作用則說明環狀RNA能夠參與疾病調節。可以預見，有miRNA的領域，就可能有circRNA功能的研究點。通過與疾病關聯的miRNA相互作用，circRNA在疾病中發揮著哪些調控作用，必將熱門。再加上circRNA穩定不易降解，是否能作為生物標志物，是否可用于診斷用途，也必然是熱門領域。例如，環狀RNA ciRS-7在人腦組織中豐富表達，與腦特異性microRNA miR-7相互作用；而ciRS-7含有多個串聯的miR-7結合位點，因此可以作為內源性的miRNA海綿，抑制miR-7活性。考慮到miR-7是各種不同癌癥相關通路的重要調節因子，同時也因能直接調節a-突觸核蛋白和泛素蛋白連接酶A（UBE2A）的表達而可能與帕金森和阿茲海默疾病的發生相關，所以ciRS-7也很有可能作為神經性系統疾病和癌癥發生的重要調節因子。
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案例展示：
案例一：整合分析mRNA-miRNA-circRNA測序數據揭示化學物致癌新觀點
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本研究以人類HepG2細胞為對象，利用高通量測序技術分析BaP作用過程中的致癌機制。整合mRNA、circRNA、miRNA測序數據（設置6個時間點），時序分析Bap處理對基因表達的影響。時序實驗發現miR-181a-1_3p隨著時間變化表達一直下調。作者以其為研究對象，尋找在BaP作用下的調控機制。靶基因預測發現，有14個差異表達mRNA（包括DNA修復基因MGMT）和16個差異表達的circRNA具有miR-181a-1_3p的作用位點。數據分析發現，隨著時間的變化，miR-181a-1_3p、MGMT和cirRNA具有一定的表達相關性。作者推測：在BaP作用下，會超量表達miR-181a-1_3p，從而抑制MGMT的翻譯，抑制DNA損傷修復；隨著時間的增加，circRNA的表達量增加，競爭性結合miR-181a-1_3p，從而解放MGMT，一定程度上對DNA損傷進行修復。
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miRNA，mRNA和circRNA之間推測的ceRNA競爭關系
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案例二：神經環狀RNA在發育期間調控突觸功能
最近，研究人員采用去除核糖體的RNA進行深度測序，并結合計算工具，已從古生菌到人類等生物中發現了成千上萬條新的環狀RNA（circRNAs）。實驗證實，一些circRNAs可以作為”海綿”吸附miRNAs，從而阻止miRNAs與其靶基因的相互作用。circRNA也可以吸附RNA結合蛋白（RBPs），進而調控細胞內相關RBPs或RNAs的運輸。盡管在神經元中已鑒定到其他種類的RNA（如miRNA，lncRNA）和基于RNA的調控模式，但卻少有circRNAs的研究。
研究發現，circRNAs大量富集于腦，來自于編碼突觸蛋白的宿主基因（圖1）。高分辨率的原位雜交顯示，circRNAs主要位于神經元樹突（圖2）。實驗證實了circRNAs在發育過程中調控突觸功能，許多circRNAs會在突觸發生時突然地改變它們的豐度（圖3）。此外，在神經活性自身穩態下降后，許多circRNAs表現出明顯的上調或下調（圖4）。在本研究中，未發現腦circRNAs可以結合miRNAs和RBPs，或是翻譯出蛋白。
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不同組織中的circRNAs表達譜，揭示circRNAs富集于腦
a. 實驗與分析流程，b. circRNAs的旋轉環形cDNA產物，c. 不同組織中環形測序數據占可比對基因組的測序數據的比例，d. 不同組織中產生circRNAs的基因占所有表達基因的比例，e. 不同組織中只在一種組織中表達的circRNA宿主基因的數量，f. 腦相比于其他組織，宿主基因位點上circRNAs與總轉錄物的豐度比例。
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腦表達的circRNAs來自編碼突觸蛋白的基因并富集于突觸組織
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腦circRNAs在發育過程中的表達譜變化
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circRNAs受到自身穩態可塑性的調控
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案例三：鑒定植物中廣泛存在的非編碼環狀RNA
本研究以水稻和擬南芥為研究對象，進行了全基因組范圍circRNA的鑒定，并對其特性進行了分析。通過對水稻和擬南芥的RNA seq數據進行參考基因組比對和過濾，判斷原始reads是否存在circRNA splicing，最后在水稻中鑒定到12,037個circRNA，在擬南芥中鑒定到6,012個circRNA。數據分析發現，有700個外顯子circRNA的親本基因在水稻和擬南芥中為直系同源基因，表明植物中的circRNA具有較強的保守性。植物circRNA表現出不同的表達模式，27個外顯子circRNAs在磷酸鹽脅迫下出現差異表達。同時發現，一些circRNA與親本基因的表達譜表現出顯著正相關。
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植物環狀RNA特征
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circRNA的高通量篩選及驗證
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Arraystar circRNA芯片
最新版本人V2.0、小鼠V2.0、大鼠V2.0。從circRNA研究領域頂尖期刊和權威公共數據庫中收錄最可靠的circRNA。剪切位點特異性探針與RnaseR預處理雙重保障，特異性檢測circRNA。結果注釋詳細，提供circRNA可能結合的miRNA以及對應host gene及線性RNA，便于從不同角度研究circRNA機制。
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circRNA qRT-PCR
康成生物采用隨機引物進行反轉錄，針對circRNA特異的back splicing site兩側序列進行引物(divergent primer)設計，該引物不受相應線性RNA分子的影響，只會對目標circRNA進行特異性擴增，實現對circRNA的表達的髙效、靈敏、準確及特異性地檢測。
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環狀RNA的功能驗證方法
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circRNA定量驗證
circRNA定量驗證手段與常規PCR手段不同，常規手段是圍繞目的片段的上下游分別設計PCR引物，稱之為convergent primer，需擴增的片段位于上下游引物之間（如圖1.1）。而對于circRNA，尤其外顯子環化circRNA，除backsplice junction位點處不同于linear RNA之外，body區與linearRNA是一致的。因此，驗證時需要特異性針對backsplice junction位點處設計primer，稱之為divergent primer（如圖），而且設計的PCR product的長度越短越好，可以增強backsplice junction位點處擴增效率。
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圖1 convergent primer vs divergent primer
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為增強circRNA的驗證效率，起始模版需滿足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。
驗證策略：對3free RNA以及genome DNA同時進行PCR擴增，電泳檢測PCR product大小（如圖）。
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圖2 circRNA引物擴增結果
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circRNA定位
位置決定功能。位于細胞核中的circRNA可能主要調控親本基因的轉錄，而位于細胞質中的circRNA可能主要發揮競爭性內源RNA—ceRNA的作用。用FISH(fluorescence in situ hybridization)熒光原位雜交技術來進行定位分析，可觀察到circRNA在哪些組織中表達，作為組織特性判斷的依據。探針設計時需跨越backsplice junction位點區域。
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circRNA Northern blot驗證
Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗證方法，需圍繞circRNA設計探針序列，而探針序列設計是驗證成功至關重要的環節。對于circRNA探針設計，我們建議以下兩點：1. 對于外顯子環化circRNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點；2.對內含子環化circRNA，可圍繞內含子區域設計探針。
驗證策略：對3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時進行雜交驗證。
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circRNA過表達
circRNA過表達思想主要源于circRNA生物形成機制，已有多篇文章報道circRNA成環機制，目前比較公認的成環機制為circRNA側翼序列的堿基互補配對，稱之為Alu結構（如圖）。
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圖3 circRNA側翼結構特征
基于circRNA側翼Alu序列特征，PCR擴增含側翼Alu序列的目標DNA序列，隨后依據對應限制性內切酶位點進行酶切，進而連接pEGFP-C1載體。連接載體進而轉染對應細胞樣本，定量PCR檢測轉染效率。基于divergent primer驗證circRNA過表達倍數。
過表達策略：
1. 擴增目標區域包含circRNA側翼Alu序列或內部堿基互補序列，側翼上下游1kb處過表達效率更佳；
2. 目標區域擴增基于基因組DNA為模版。
circRNA敲除
circRNA敲除思路主要針對circRNA backsplice junction處序列信息設計siRNA，對于內含子環化circRNA，也可針對內含子區域設計相應siRNA進行干擾。Divergent primer驗證circRNA敲除倍數。
敲除策略：
1、外顯子環化circRNA，針對backsplice junction位點前后序列設計siRNA，如圖所示；
2、內含子環化circRNA，除針對backsplice junction位點前后序列設計siRNA序列以外，也可針對內含子區域序列設計siRNA。
3、每個siRNA設計對應的對照，backsplice junction位點一端互補配對，另一端錯配，如圖3所示。
圖4基于siRNA敲除策略
circRNA數據庫
circbase
在circBase（http://www.circbase.org/cgi-bin/listsearch.cgi）中，我們可以通過circRNA名稱（hsa_circ_0010153），轉錄本名稱（NM_133494），染色體定位（chr1:12359258-12382803）檢索circRNA的信息（序列，定位，gene_symbol等信息），你也可以直接檢索mRNA相關（TP53）或是生物學過程相關（apoptosis）的circRNA。
circBase有blat功能可以進行序列比對，用于了解基因的物種保守性，不過物種較少
推薦使用UCSC（http://genome.ucsc.edu/）的blat功能
其實circBase的序列信息還是源于UCSC
但是在UCSC中直接用hsa_circ_0010153直接搜，還偏偏搜不出下面這樣的結果
點開一條序列，即可獲取該條序列的信息
前面在circBase中，我們已經獲取了circRNA的位置信息了，所以就不需要再一個個點開查看基因序列了，直接在UCSC中輸入位置信息即可獲得完整的基因序列。
RegRNA2.0
那我們獲取了基因序列可以干嘛呢？第一反應當然是預測miRNA咯~
在RegRNA 2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）中，我們可以用基因序列做很多事情，當然也包括預測miRNA。
miRNA預測結果如下
circlnteractome
嫌上面這個預測circRNA的miRNA太麻煩？那你可以試試CircInteractome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）
就是這么簡單粗暴
以上的檢索結果如果都不能讓你滿意，你可以試試曲線救國的方式，用circRNA的gene sybmol來搜索相關的miRNA，比如hsa_circ_0009973的gens symbol是VPS13D。不過這樣一來你得確認circRNA與miRNA結合區域在mRNA和circRNA序列中都是存在的，如果結合區域由于剪切方式不同在circRNA中被剪沒了那就玩不起來了。此外由于circRNA是環狀的，所以在和miRNA結合時，自由能等等參數肯定會由于分子構象發生改變，所以預測的準確性也會打折扣。
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